固氨酶活性中心模型的演进和酶催化机理

本文提出固氮酶活性中心的骈联双座双立方烷原子簇结构的活性中心模型,[S~*Fe_3S_2~*(L)]Mo[(L’)S_2~*Fe_3S~*],其中L和L’代表两个可以移开的配位体,如N_2,-H,或-NH_3。这个模型是前阶段先后提出的骈联双座单立方烷原子簇结构模型,Fe_2S_2~*·Mo_2O_2,和骈联双座三立方烷原子簇结构模型,Fe_2S_c~*(L)(L’)Mo_2[S_3~*Fe_3S~*]_2,的又一次演进。这三个模型所共有的骈联双座原子簇结构特征和三核络合固氮方式,主要都是以固氮酶己知反应的十来种底物和抑制剂CO作为化学探针并应用络合催化原理而推断出来的。至于钼离子的价态和周围微环境,以及三核究竟是两钼一铁还是一钼两铁,则是参考最近国际上关于固氮酶的科学实验新成就而作出相应的修正和演进的。骈联双座双立方烷原子簇结构(含单钼)比较符合Orme-Johson和Munck等的顺磁共振和穆斯鲍尔谱实验结果,能说明比较多的实验事实。本文还扼要地讨论了固氮酶反应中ATP驱动的电子和质子传递机理。     

共边活口骈联双立方烷固氮酶活性中心固氮模型的量化处理

本文着重对我校固氮研究组1981年提出的共边活口骈联双立方烷固氮酶活性中心活化分子氮的模型,作了多原子簇络合的EHMO量化计算;并相应地计算了美国Newton差不多同时提出的固氮模型的核心部份。对比和分析几种络合N_2方式的总能量、络合能和电荷分布等物理化学性质。结果表明了两种固氮模型的相似性及它们酶促分子氮等底物的合理性。     

化学模拟生物固氮——Ⅶ.乙炔选择性还原成乙烯作为原子簇活性中心多核络合活化底物的一种判据

系统地比较了FeMo-co和固氮酶的各种模拟体系在KBH_4还原乙炔为乙烯的反应中的催化活性和选择性。FeMo-co(活性:转变数为34;选择性:99％C_2H_4)和本实验室合成的模型化合物(活性:转变数为20～30;选择性;91～95％)比其它固氮酶的模拟体系(MoO_4~(2-)-CySH;MoO_4~(2-)—CySH—Fe~(2 );MoOS_4~(2-)—胰岛素;[Fe_4S_4(SCH_2Φ)_4]~(2-);和MoS_4~(2-))具有较高的活性和选择性;这可作为FeMo—co及其合成模拟物的原子簇活性中心多核络合活化底物分子的一种判据.     

关于固氮酶的作用机理和活性中心結構

本文根据固氮酶已知的反应和络合催化原理,讨论了固氮酶的作用机理和活性中心结构;提出了由Fe_2S_2·Mo_2O_2原子簇构成的两个偶联在一起的两钼一铁三核活性中心(2 Mo—1 Fe)的看法;这两个偶联的三核活性中心也是放氢的活性中心.根据这活性中心模型,说明了各种底物分子的还原反应机理和CO只抑制分子氮、炔类、腈类、异腈类等6π-配位体型的底物分子的还原反应,而不抑制放氢反应的原因,以及ATP的作用机理和ATP/2比值与电子倒流的关系.     

固氮酶活性中心的结构和反应机理

1973年以来,各国许多学者提出了各自不同的固氮醇活化模型和作用机理。但都是考虑Mo原子既是吸附分子氮的中心,又是还原氮的中心。他们的设想主要建立在模型化合物体系还原氮成功的基础上。我们分析了Mo在固氮酶中价态,根据实验结果推测应为Mo(111)。从配位化合物取代反应理论考虑,Mo(111)为惰性反应。不宜作活化氮吸附中心。此外,我们又分析了固氮酶和钼铁硫簇化合物的许多性质。提出固氮酶催化还原底物应有双中心机理协同完成。一个是由二个Fe原子组成的吸附N_2中心,另一个是钼铁硫原子簇组成的电子还原中心。讨论了反应速率的决定步骤是电子传送。对固氮酶中Fe作底物吸附中心的可能性罗列了大量实验结果进行论证。并讨论了氮分子在二个Fe之间η_2吸附方式对活化氮最有利。用双中心机理顺利地解释了固氮酶的各种反应性。     

化学模拟生物固氮——ⅩⅣ EHMO法研究环丙烯等固氮酶底物的μ_3η~2型络合方式和分子氮还原加氢中间态

迄今所知的固氮酶十来种底物中,除极少数例外,大多数都是末端具有三重键(或环丙烯型的准三重键)的小分子。从这些底物的已知酶促反应和在固氨酶活性中心的相对配位亲合力,我们曾推断这些底物分子很可能是以相同的μ_3(η~2)型方式络合在固氮酶活性中心上的,并在此基础上提出了并联双座双立方烷型原子簇结构的活性中心模型。同时指出,对于那些末端有三重键但无“尾巴”的底物分子,如N≡N,C≡N~-,和HC≡CH,在三核活性中心(1Mo—2Fe)进行μ_3(η~2)型络合,有两种可能的方式即双端基加单侧基型络合和单端基加双侧基络合。本文报导了EHMO近似计算和定性的分子轨道讨论结果。结果表明:在环丙烯情况下,双(准)端基加单侧基型络合比单(准)端基加双侧基型络合在能量上要有利得多,而且它的络合键能相当大;在N≡N和HN≡C(假想的异氢腈酸)情况下,双端基(或准端基)加单侧基型络合比单端基加双侧基型络合在能量上亦较为有利;乙炔的情况也是这样,但两种络合方式的络合键能之差比较小。这些结果与下述的实验事实是一致的:环丙烯是固氮酶的底物,而且是N≡N酶促还原加氢的强竞争性抑制剂;两种按μ_3(η~2)型方式络合的炔烃过渡金属原子簇络合物都已发现。环丙烯和N≡N在三核活性中心的双端基(或准端基)加单侧基型络合也能较     

化学探针方法研究固氮酶M—簇和P—簇对的结构与功能关系

根据配位催化原理和化学探针思路，推断了野生菌固氮酶在酶促固氮反应中（Ｍｏ）位直接参与结合分子氮（Ｎ＝Ｎ）；论证了固氮酶钼铁蛋白Ｍ－簇（Ｋｉｍ－Ｒｅｓｓ模型）必须是活口的钼－铁－硫原子簇笼，对底物和抑制剂有人子识别能力，只有Ｎ＝Ｎ才能作为底物络合在（Ｍｏ－３Ｆｅ，３Ｆｅ）七核活性中心，而且必须有一条质子（和电子）接力传递链到达（Ｍｏ）位，Ｎ＝Ｎ才能排去氢基配体而进到（Ｍｏ）位，（否则就只能象ＨＣ＝Ｃ     

化学模拟生物固氮——Ⅵ.铁钼辅基模型化合物的合成及其催化性能

本文讨论了先前我们提出的固氨酶活性中心骈联双座双立方烷原子簇结构模型的一些特征。根据这一模型。设计了铁钼辅基模型化合物的合成方案,合成了三系列的铁钼辅基模型化合物,其Mo、S~*、Fe之比如同这一模型所要求的,为1:～6:6～8。由氯化物系列和柠檬酸盐进行配位体交换而得到的柠檬酸盐系列中的两个样品,在KBH_4还原C_2H_2为C_2H_4的反应中具有很高的催化活性(按每个Mo计算,转变数为20～30分~(-1))和选择性(91～95％),接近天然的铁钼辅基的水平,并在与Av突变种UW_(45)重组后,按Shah和Brill的方法测定,显示出明显的固氮酶活性。     

固氮酶活性中心模型和铁钼辅基模拟体合成的研究进展

前阶段(1973—1976),我校蔡启瑞教授以固氮酶的十来种底物作为化学探针,并根据络合催化原理,直接推断N≡N,n—R—C≡N,n—R—N≡C,n—R—C≡CH等固氮酶的底物分子是按μ_3(η~2)方式配位络合在三核活性中心上的(但从当时已知的科学实验,尚未能确断活性中心究竟含一个或两个钼),并进一步推断两个这样的三核活性中心通过共用钼而骈联在一起,成为骈联双座的结构,从而提出了第一个立方烷原子簇结构的固氮酶活性中心模型。1977—1978年,又进行了两次演进,于1978年7月首先提出钼上不含有机硫配位体的骈联双座双立方烷的固氮酶活性中心模型,即“厦门模—Ⅲ型”[S Fe_3S_2(L)]Mo[(L′)S_2Fe_3S]。其中L和L′代表两个活动的配位体。这模型能较好地说明许多实验事实,并为合成铁钼辅基模拟体指出了方向(上述这一模型和“厦门模型—Ⅱ”、“福州模型—Ⅱ”的关系,详见文献[2]b和[3])。     

花生根瘤菌在自生条件下固氮和吸氢相关性

花生根瘤菌x_(-1)菌株在自生条件下和合适的培养基中,可诱导固氮酶及氢酶的活性,固氮酶反应产生的H_2(内源H_2)能直接诱导氢酶,氢酶活性表达的时间进程是在固氮反应之后,在外源H_2的存在下,固氮酶和氢酶则可同时表达,不同有机碳化合物对固氮酶与氢酶的影响不同,丙酮酸明显提高固氮活性,但对氨酶没有促进作用,蔗糖对固氮活性没有促进作用但对吸氢表现促进作用,分子H_2明显提高固氮活性,2.4-二硝基苯酚抑制需H_2的固氮活性,在外源H_2存在下其抑制作用更明显,铵抑制固氮酶的形成、固氮酶受铵抑制时氢酶也相应受到抑制。     

氨合成铁催化剂活性中心模型及分子氮的络合活化

根据α-Fe晶格参数,表面原子的配位不饱和性,反应的动力学几何因素,络合催化原理,以及由表面原子剩余杂化轨函所组成的基函的量子化学近似计算,本文提出N_2的端基吸附不是目前一般认为的垂直吸附在(111)晶面的底端原子上,而是N_2端基吸附在(111)晶面配位较底端原子不饱和的一个表面原子上,端基吸附与(111)面斜交约20°角,同时有三个与N_2分子中心相距约2.48A的最邻近铁原子侧基络合,生成端基加三侧基ω1,μ_3(η~2)型络合物。氨合成铁催化剂活性中心,除了这样的4-Fe原子簇吸附中心外,还需要一个和吸附中心毗邻并合用二原子的4-Fe原子簇氮分子离解中心,共构成6-Fe原子簇活性中心。本文提出的活性中心模型及吸附态,解释了H_2在铁屑上及钼屑上的吸附场电子发射显微镜图象(Brill et al.,＆ Ishizaka et al.);N_2或NH_3对催化剂预处理所引起的Mossbauer谱图象改变及氨合成活性的增加(Boudart et al.);N_2在Fe上的X光光电子能谱(Kishi et al.);说明了由场离子质谱证实的N_3~ ,N_4~ 的生成机理(Schmidt);~(14)N_2-~(15)N_2在Fe,Fe-Al_2O_3-K_2O上同位素交换机理,提出N或NH的表面迁移是同位素交换决定性步骤,从而解释了在Fe,Fe-Al_2O_3-K_2O上及H_2存在下同位素的显著差异及交换动力学(Ozaki et al.)。 ω_1,μ_     

簇结构敏感型的过渡金属催化作用及其与原子簇络合物催化作用的关联

本文根据原子簇活性中心的概念,讨论过渡金属催化剂上炔烃的选择加氢,甲基异腈的异构化为C腈,分子氮的加氢成氨,水煤气费—托合成,以及苯的氢氘同位素交换等簇结构敏感型的催化反应和催化作用机理,及其与过渡金属络合物配位化学,尤其是与过渡金属原子簇络合物(包括固氮酶)的配位络合催化作用的相互关联;并指出,深入研究这种关联对于建立催化剂分子设计的科学基础具有重要意义。     

合成氨铁催化剂N_2络合活化模型

采用电荷自洽推广的休克尔近似,以基态分子氮为标尺,计算了以α-Fe为主催剂的氨合成催化作用中若干种N_2 络合吸着模型和活化方式,指出N_2 在多晶铁催化剂上的离解化学吸附是氨合成的决定步骤。结果表明 N-N 键电子集居数有相当大的下降,而且N_2 主要扮演π-电子接受体的角色。     

固氮酶催化作用机理及其化学模拟

固氮酶是某些微生物在常温常压下固氮成氨的主要催化剂,其催化机理和化学模拟是国际上长期致力研究的对象。尽管人们已经揭示了固氮酶催化活性中心——铁钼辅基（FeMo-co)MoFe7S9（R-高柠檬酸）的结构,然铡,有关FeMo-co生物合成的详细途径和其中包含的钼铁转移和利用;固氮酶在哪些活性位和按什么模式结合N2,C2H2、CO等多种底物或抑制剂;以及其中涉及的电子和质子传递过程等许多问题,至今尚有待解决。本文将综述这些问题的研究进展和厦门大学固氮组最近五年来的相关研究工作。     

棕色固氮菌的氢酶初步研究

棕色固氮菌(Azotobacser Vinelandii—230)中与固氮酶共存的氢酶属于单向吸氢的氢酶,其中以粒子态存在者约占其总活力的78％,可溶态占22％。此二态酶对冷热稳定,最适反应温度和利用多种电子受体吸氢等方面均相似,但在耐热性、温度曲线的形式及对某些电子受体的亲和性方面有些差异。乙炔、Na~+离子及氧对酶的吸氢活力有抑制作用。菌体的氢酶活力,有氨培养比无氨培养的低86％左右;大量氨培养的UW—45菌体仍有氢酶活性,但比氨耗尽的UW45菌体低55％左右。钨代替钼培养的菌体无固氮酶活性,其粗提液氢酶活性也极低。由此可见,氢酶活性与固氮酶活性有极为密切的关系。     

《固氮酶活性中心模型物中硫的微量测定》一文的补充

本刊1980年第二期109—111页登载的我们所写《固氮酶活性中心模型中硫的微量测定》一文研究简报,因前文过于简略,现有几点需加以补充说明如下: 1.固氮酶活性中心模型物的探索合成研究为兰州大学有机化学所有机合成研究室与中国科学院福建物质结构研究所协作进行,兰州大学有机化学研究所有机分析研究室配合他们的合成研究承担了部分合成样品的元素分析任务而开展了一些元素微量分析新方法的研究,以求解决分析这类样品时常规方法所不能获得准确数据的问题。本工作所提出的分析方法就是针对这些含钼、铁、鎂、氮、硫及卤素的有机金属化合成物中硫的微量测定而设计的。本文中所用一些固氮酶模型化合物样品均由兰州大学有机合成研究室交来委托分析的,谨致谢意。由于他们的探索研究工作正在进行中,对于样品的合     

化学模拟生物固氮——Ⅺ 固氮酶铁钼辅基模拟物的生物活性

据固氮酶厦门模型Ⅱ合成的固氮酶铁钼辅基模拟物与缺陷型棕色固氮菌uw-45提取液重组后,在完全的酶促反应条件下,具有明显的生物催化活性,其还原乙炔为乙烯的转化数通常在3—6(分~(-1))之间,相当于天然铁钼辅基活性的1—2％左右;还原分子氮为氨的转化数在1.5—3(分~(-1))左右,可用普通微量氨扩散法和Nessler比色法检出。重组模拟物的乙炔转化数与氮转化数之比值符合于棕色固氮菌活性固氮酶相应的转化数之比。经柠檬酸盐处理后,以氯为外配位基的模拟物的重组活性可显著提高。     

固氮酶活性中心MoK EXAFS谱拟合的初步探讨

本文以曲线拟合方法,找到钼微环境的信息为4Mo—S_1(R=2.35A)+2Mo—Fe(R=2.72A)+Mo—S_2(R=2.45A)+Mo— N(R=2.10A)的组成时,其EXAFS谱与固氨酶C_pI~(Sr)的EXAFS谱最佳拟合。组成为4Mo—S_X(R=2.35A)+2Mo—Fe(R=2.72A)+3Mo—N(R=2.10A)时,与FeMo—Cofactor的EXAFS谱最佳拟合。从而证明我校提出的并联双座(活口)共角(或共边)双立方烷型原子簇结构的固氮酶活性中心模型的合理性。     

固氮酶反应中ATP驱动电子传递的化学模拟——Ⅰ.[Fe_4S_4(SR)_4]~(2-)原子簇与ATP络合的极谱及电子吸收光谱的研究

将ATP加到[Fe_4S_4(SPh)_4]~(2-)的DMF-H_2O溶液中,引起[Fe_4S_4(SPh)_4]~(2-)原子簇的氧化还原电位从-1.00±0.01伏移至-1.49±0.01伏,负移490mV左右;使[Fe_4S_4(SPh)_4]~(2-)原子簇的电子吸收光谱特征吸收强度明显降低;同时加速[Fe_4S_4(SPh)_4]~(2-)与亚甲蓝的氧化还原反应,这种加速效应比ADP明显,而ADP又比AMP明显得多。根据这些实验事实,可以认为ATP能以末端的γ-PO_4基团,或γPO_4和β-PO_4基团与[Fe_4S_4(SPh)_4]~(2-)原子簇络合或螯合,引起后者的配位场增大,提高电子的输出能力。本文还讨论了ATP与[Fe_4S_4SPh)_4]~(2-)原子簇的络合方式,进而探讨了ATP在固氮酶中的结合部位和作用机理。     

活性炭负载Fe,Ni催化氨分解的研究

以Fe,Ni为主活性组分,K,Mo,Co等为助催化成分,采用多步浸渍、直接高温分解、再分步还原的办法,使其负载于国产活性炭载体上,研究了Ni,Fe两类催化剂对氨的催化分解性能.结果表明,活性炭负载的Fe催化剂比负载的Ni催化剂的活性高.Fe-Mo/C的催化活性最好,在650℃时就能使氨气基本分解完全.助催化成分对Fe催化剂活性促进作用大小顺序是Mo>K>Co,而K,Mo对Ni催化剂活性的促进作用很小.XRD研究表明,Fe-Mo/C催化剂的主要晶相为FeMo,Fe2(MoO4)3,Fe2O3及少量的Fe3O4和石墨化C;催化反应后,出现了-αFe和较多的石墨C晶相,Fe2(MoO4)3及Fe2O3,Fe3O4衍射峰基本消失,表明铁化合物已被还原,且活性炭进一步石墨化了.FeMo化合物的形成是Fe-Mo/C活性高的一个重要因素.