NC膜富集法、实时荧光PCR法、培养法检测志贺菌的比较研究

观察、比较硝酸纤维素膜富集法、实时荧光PCR法及传统培养法对志贺菌阳性检出率的不同.对137例临床样本分别采用硝酸纤维素膜富集法、实时荧光PCR法、传统培养法进行检测.3种方法检测结果阳性率分别为13.14%、20.44%、8.03%.硝酸纤维素膜富集法是在培养法基础上进行了一些改进,采用"先分离再培养"的方法,与传统培养法比较,检测结果阳性率明显提高,两者比较,差异有统计学意义(P0.05).另一方面,硝酸纤维素膜富集法耗时较短,特异性高,成本低并且无需特殊设备,特别适宜基层检测单位和健康筛查单位使用.实时荧光PCR法检测结果阳性率最高,但同时假阳性率也最高.传统培养法检测结果阳性率最低,但现今在临床工作中仍以传统培养法作为志贺菌检测的标准方法.研究结果显示,硝酸纤维素膜富集法检测志贺菌,明显提高了检测结果的阳性率,且特异性高、耗时较短,具有很好的临床应用前景.     

用RT-PCR方法检测血液及尿液中肾综合征出血热病毒

目的应用逆转录聚合酶链反应方法(RT-PCR)对临床诊断或拟诊为肾综合征出血热(HFRS)的患者的血液及尿液标本进行检测.方法对临床拟诊断或拟诊HFRS患者198名(Ⅰ型为147例,Ⅱ型为51例)的血清、尿液标本进行RT-PCR方法抗体检测,并设置对照血清.结果紫外灯下,165例在237 bp处出现橙黄色带,阳性率为83.3%,对尿液进行检测,其结果均为阳性.标准病毒株、阳性对照血清为阳性.阴性对照、健康人血清、尿液标本均为阴性;免疫荧光抗体检测,血清抗体阳性173例,阳性率为87.2%.尿液阳性仅为116例,阳性率为58.4%.结论用RT-PCR方法检测HFRSV具有灵敏度高、特异性好、快速等优点,方法简便,适于临床应用.     

荧光定量PCR检测HBV DNA及临床意义

目的:了解HBV感染者的常见血清学组合的HBV DNA阳性情况,探讨其临床意义。方法:对260份血清同时用荧光定量PCR与ELISA方法进行检测并进行评价。结果:40例HBsAg(+)/HBeAg(+)/抗-HBc(+)组血清HBV DNA全部阳性,阳性率为100％,含量为10~(7.62±0.69)cps/mL;110例HBsAg(+)/抗-HBe(+)/抗-HBc(+)组血清58例阳性,阳性率为52.7％,含量为10~(4.64±1.31)cps/mL;35例HBsAg(+)/抗-HBe(-)/抗-HBc(+)组血清20例阳性,阳性率为57.1％,含量为10~(4.93±1.42)cps/mL;75例HBsAg(-)组血清中,5例HBV DNA阳性,阳性率为6.7％,含量为10~(3.68±0.46)cps/mL。结论:乙型肝炎患者HBV荧光定量检测是病毒复制最直接可信的指标,动态荧光定量PCR检测HBV DNA,对动态监测乙型肝炎感染的病原学变化及判断有关药物抗-HBV复制是否有效具有一定的临床意义。     

吉林地区384例HBeAg阴性乙肝患者HBV-DNA检测结果分析

目的了解吉林地区HBeAg阴性乙型肝炎患者乙肝病毒血清标志物(HBV.M)与乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)的相关性.方法收集吉林地区384例HBeAg阴性乙型肝炎患者,按HBeAg阴性的不同模式分为6组;采用实时荧光定量PCR方法检测HBV-DNA,酶联免疫法(ELISA)法检测HBV-M.结果HBeAg阴性乙肝患者HBV-DNA阳性率为48.7%.结论HBeAg阴性不同模式的乙肝患者间HBV-DNA阳性检出率的差异较大.HBeAg阴性乙肝患者中仍有部分患者存在乙肝病毒颗粒复制.     

支原体种属特异性PCR引物的设计及对细胞培养物支原体的检测

目的快速全面检测感染细胞、疫苗等多种生物制品中的支原体.方法从多种支原体的16SrRNA核酸序列中选择了两段高度保守的核酸序列,作为支原体种属特异性引物,对标本进行检测.结果用这对种属特异性引物对已知阳性的50份标本进行检测,检测结果显示全部为阳性.应用于实践,检测了89份疫苗标本,阳性率为31.4%,而用常规培养法检测阳性率为12.3%.结论用该种属特异性引物检测支原体具有检测速度快、检测灵敏度高、特异性强等优点.     

应用PCR技术快速检测妇科样本中的念珠菌分布

目的:传统的念珠菌检测方法存在耗时长、阳性率低的缺点,本研究将PCR技术应用于妇科念珠菌检测中,寻找出一种能够快速、准确、有效检测妇科念珠菌的方法.方法:收集临床妇科阴道分泌物样本100例,科玛嘉显色培养基进行培养,同时应用PCR方法对100例临床样本进行检测鉴定.结果:在100例样本中,传统培养方法的阳性率为41%,PCR方法检测的阳性率为72%.传统的念珠菌检测方法耗时长,尤其是培养法,至少需时48 h;应用PR方法对念珠菌进行检测,只需要5 h,且阳性检出率和准确性较高.结论:相对于念珠菌传统培养方法,PCR方法是一种更加简便理想的检测方法.     

仙台病毒荧光定量 PCR 检测方法的建立及初步应用

目的 建立敏感特异的仙台病毒( SeV)荧光定量 PCR 检测方法,并初步应用。 方法 将不同株 SeV 病毒序 列进行比对,选择对保守区域设计合成引物。 人工合成 SeV 基因组 12 181 ~ 12 480 DNA 序列,转入质粒中,作为仙 台病毒质粒标准品,建立 SYBR 染料法荧光定量 PCR 方法,并对样本进行 SeV 测定。 结果 建立了特异性的检测 SeV 的 SYBR 荧光定量 PCR 方法,该方法对 SeV 最低检测限度为 10 copies / μL。 将所建立的实时荧光定量 PCR 方 法用于 40 只 SPF 小鼠和 58 只裸鼹鼠的肺组织样本的检测,检测结果为仙台病毒核酸阴性;检测 4 只成年屏障环 境饲养黄鼠肺组织和 5 只清洁级小鼠肺组织,检测结果为仙台病毒核酸阳性率 100% 。 结论 该研究建立的 SYBR Green 染料法荧光定量 PCR 方法能特异敏感地检测仙台病毒。     

血清降钙素原检测联合微生物培养的临床应用价值探讨

目的探究血清降钙素原检测联合微生物培养的临床应用价值。方法将2016年1月—2017年3月于我院进行血清降钙素原检的870例患者纳入研究,其中接受过血培养检测和(或)细菌培养的患者451例,采集其临床资料及检测结果进行统计分析。结果此次试验共870例患者接受PCT检测,阳性率为40.00%(348/870),共350例患者接受血培养检测,阳性率为20.29%,远低于PCT检测。在PCT检测的各项参数上,其敏感度为77.46%,特异度为55.20%,阳性预测值为30.56%(55/180),阴性预测值为90.59%(154/170);共71例血培养阳性患者,PCT阳性率为77.46%;共257例细菌培养阳性患者,PCT阳性率为52.92%;共84例真菌培养阳性患者,PCT阳性率为48.81%。结论血清降钙素原检测具有敏感度、特异度高的优点,操作便捷快速,可用作常规实验室检测。     

从业人员预防性健康体检沙门/志贺氏菌检验PCR方法快速筛查的应用

采用实时荧光定量PCR方法快速检测食品等从业人员肠道致病菌,并与培养法进行比较,了解实时荧光定量PCR方法的应用价值.方法:随机采集96 752份从业人员肛拭子标本分别进行实时荧光定量PCR方法和培养法检测沙门氏菌和志贺氏菌,比较两种方法对两种肠道菌的检出率.结果:96 752份标本中,实时荧光定量PCR方法共检测出91份标本沙门氏菌阳性,其中83份分离阳性,41份志贺氏菌阳性,其中30份分离阳性.而传统培养法检测未检出.结论:实时荧光定量PCR方法可以很好的应用在从业人员肠道致病菌的筛查,并且可以提高从业人员肠道致病菌的检出率和准确性,节省劳动力,降低工作人员的工作强度.     

HBV血清学标志物与HBV DNA定量结果比较分析

探讨乙肝患者血清标志物HBV-M和HBV-DNA之间的关系及临床意义。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测HBV-M,用荧光定量PCR方法检测HBV-DNA载量,对结果进行比较分析。897例病人中得出17种血清学模式,各种组合的HBV DNA的阳性率存在显著性差异,HBeAg阳性组合模式的HBV-DNA检出率较高。HBV-M与HBV-DNA两种方法联合检测对乙肝患者的诊断和疗效观察有重要的临床价值。     

实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立

目的 建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法 针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果 该方法在模板浓度为5×100～5×106 copies/μL之间呈良好的线性关系(R2=0.9972)且扩增效率为98.11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3.33%(2/60)、1.67%(1/60),细胞样品支原体检测阳性率均为5%(3/60)。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。     

幽门螺杆菌感染与胃癌的关系

目的 :探讨幽门螺杆菌 (简称 Hp)感染与胃癌的关系。方法 :43例胃癌患者的新鲜癌手术标本及血清标本、36例十二提肠溃疡患者 (对照组 )的胃窦粘膜组织及血清标本入本组研究。分别采用 PCR及血清学试验检测其 Hp感染状况 ,两项检测均为阳性者即确立为 Hp感染。结果 :(1) 4 3例胃癌中 ,Hp阳性 30例 ,阳性率 6 9.77% ;36例十二指肠溃疡中 ,Hp阳性 30例 ,阳性率 83.33% ,两组阳性率相比差异无显著性。Hp阳性患者中 ,胃癌及对照组 cag A基因阳性分别为 2 4例、2 5例 ,阳性率分别为 80 .0 0 %、83.33% ,两组阳性率相比差异无显著性。(2 ) 4 3例胃癌中 ,高中分化腺癌组 Hp及 cag A检出率分别为 6 2 .5 0 %及 70 .0 0 % ,低未分化癌组 Hp及 cag A检出率分别为 74.0 7%及 85 .0 0 % ,但两组 Hp及 cag A检出率统计学上均无显著性差异。结论 :(1) Hp感染及 cag A+ 菌株感染不是胃癌发生的唯一或必须因素。 (2 )胃癌的分化程度与 Hp及cag A+菌株感染无明显相关性。     

基于小鼠肝炎病毒研究遗传工程小鼠隔离检疫设计

目的以小鼠肝炎病毒(MHV)为例,研究两种常用小鼠感染MHV后粪便中病毒核酸检测量与血清特异性抗体的变化,探讨实验动物病原微生物感染的检测设计。方法用MHV病毒核酸检测阳性的脏垫料持续饲养C57BL/6和BALB/c小鼠(n=20) 28 d,进行脏垫料接触感染。之后所有小鼠使用无菌垫料进行单笼饲养,每周收集新鲜粪便和血清样本,经Taqman荧光定量PCR(qPCR)和ELISA法检测后进行统计分析。结果对于BALB/c小鼠,采用qPCR法检测时,在实验第21天即有阳性检出(阳性率20%),第28天阳性检出率达到最高,为80%,第42天阳性检出率为50%,至第56天无阳性检出。血清ELISA检测发现,实验第42天才有MHV特异性抗体检出(阳性率为50%)。对于C57BL/6小鼠,采用qPCR法检测时,在第28天和第42天分别从20%小鼠粪便中检出MHV。而采用ELISA法在整个实验期均未检出特异性阳性抗体。结论在隔离检疫和常规病原检测中,建议选用BALB/c小鼠作为哨兵鼠,替代C57BL/6小鼠。由于qPCR法具有早检出和更高检出率的优点,建议在隔离检疫早期采用基于分子生物学的粪样核酸检测法替代ELISA法。     

应用PCR技术检测结核菌的临床研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对２４４例呼吸疾病患者临床标本进行结核菌ＤＮＡ检测，并同时与涂片抗酸染色结果进行比较。结果显示：１１２例结核标本涂片和ＰＣＲ检测阳性率分别为１６．１％和５２．７％，两者差别有显著性（Ｐ＜０．０１）。９４例涂阴结核标本ＰＣＲ阳性达４５．７％。结果表明应用ＰＣＲ技术检测结核杆菌ＤＮＡ具有快速敏感、特异性较高等优点，尤其对涂阴病人具有较大诊断价值     

乙型肝炎病毒母婴传播问题探讨

探讨乙型肝炎病毒宫内感染及乳汁感染的母婴传播问题,用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对７５例ＨＢｓＡｇ阳性产妇初乳及其新生儿外周血进行ＨＢＶ ＤＮＡ的检测;同时应用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）测定产妇初乳中乙肝病毒５项标志物（ＨＢＶＭ）。结果为１）１７５例初乳中ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率为６８％,高于同组新生儿外周血ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率３４．６７％,有显性差（Ｐ〈０．０１）;ＨＢＶＭ三项阳性各组二埂有显性差异（Ｐ〈０．０５）．２）ＨＢｅＡｇ阳性初乳及新生儿外周血ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率均量高,与ＨＢｓＡｇ、抗－ＨＢｃ比较,有显性差异（Ｐ〈０．０１,Ｐ〈０．０５）。表明初乳排毒率高于内传染率,母婴传播率与母血中ＨＢＶＭ传染性呈正相关。     

Efficient transformation and expression of gfp gene in the edible mushroom Pleurotus nebrodensis

An efficient transformation method mediated by PEG-protoplasts was developed for the newly commercial edible mushroom Pleu-rotus nebrodensis. Two plasmids were used to co-transform protoplasts of P. nebrodensis. One plasmid is pAN7-1 containing a positive selectable marker gene hph conferring hygromycin B resistance. Another plasmid is pBIue-GFP containing a reporter gene gfp conferring green fluorescent protein. PCR and Southern blot analysis showed that hph gene or/and gfp gene were integrated into the genome of P.nebrodensis transformants. The transformation efficiency of the positive selectable marker gene hph was 3 transformants per microgram of plasmid pAN7-1 DNA, which was about 30 times higher than that previously reported in thoroughly studied Pleurotus species such as Pleurotus ostreatus. The transformation efficiency of the reporter gene gfp was 9 transformants per microgram of plasmid pBlu-GFP DNA. The co-transformation efficiency was 23.68%. This is the first report that a "reporter" gene, green fluorescent protein gene can be successfully stably expressed in this Pleurotus species.     

用生物素标记核酸探针检测鼠金黄色葡萄球菌的研究

利用聚合酶链反应技术从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出 6 78bp耐热核酸酶nuc基因特异性片段 ,经生物素标记后作为核酸斑点杂交试验的探针 ,对实验动物的金黄色葡萄球菌及其临床样品进行了检测。结果显示 ,标记探针与金黄色葡萄球菌DNA呈杂交阳性 ,而与链球菌、大肠埃希氏菌和巴氏杆菌DNA呈杂交阴性 ,斑点杂交的检测灵敏度为 1pg基因组DNA。用斑点杂交试验和PCR对 2 4 0份临床样品进行了检测 ,检出率为 2 9% (7 2 4 0 ) ,符合率为 10 0 %。这些试验结果表明 ,研究制备的核酸探针及建立的斑点杂交试验具有较高的特异性和敏感性 ,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的快速检测     

ELISA和PCR法在研究乙肝病毒传播途径中的应用

应用HBV表面抗原酶标试剂盒和诊断HBVDNA的PCR试剂盒分别检测可能污染有HBV的不同来源标本30份，结果ELISA法检出HBsAg阳性5例，检出率16．7％；PCR法检出HBVDNA阳性12例，检出率40％，明显高于ELISA法，提示应用PCR技术探讨乙肝病毒传播途径似乎效果更好。     

用双探针原位杂交法检测常见肝病组织中输液传染性病毒DNA

目的：建立肝组织输液传染性病毒DNA(TTVDNA)的原位杂交检测技术，探讨TTVDNA在肝组织中的分布。方法：采用PCR扩增法，分别合成地高辛标记的Gla、G2b两种亚型的双链TTVDNA探针。同时应用两型探针对22例血清学检查无甲-庚型肝炎病毒感染的肝病患者肝组织TTVDNA进行原位杂交检测，并将检测结果与巢式PCR法检测配对血清TTVDNA的结果进行比较。结果：原位杂交阳性信号主要定位于肝细胞核，少数位于胞浆。22例肝病患者肝组织标本中TTVDNA原位杂交阳性率68.2％（15/22），其中慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌患者中原位杂交阳性率83.3％（15/18），4例肝破裂、肝良性肿瘤患者TTVDNA原位杂交检测皆为阴性。配对血清TTVDNA阳性率63.6％（14/22）。血清与肝组织TTVDNA检测符合率86.4％（19/22）。结论：双探针原位杂交检测具有较高的特异性和灵敏性，有助于肝病病因的分析。TTVDNA在慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌的肝组织中检出率较高，提示TTV可能与这些肝病有关。     

132例急性乙型肝炎患者HBV基因型分析

为检查本地区HBV感染者基因型，对132例本地区急性乙型肝炎患者血清中HBV、DNA通过PCR检测技术进行基因型分析，结果：C型101例（75．5％），B型15例（11．7％），BC混合型12例（8．7％），A型1例（0．9％），检测结果与KaoJ H、XinDing等报道基本相似．但在132例患者中，有3例未确定基因型，原因，有待进一步探讨．