含PGK启动子慢病毒表达质粒的构建与鉴定

为了构建一个含有人源PGK1(human phosphoglycerate kinase 1)启动子的慢病毒表达载体 pL-PGK-GFP.采用PCR从人组织中扩增PGK1基因的启动子部分,再用酶切-连接的方法将扩增的启动子区片段亚克隆入慢病毒表达质粒pL-EGFP中,再用测序、酶切和瞬时表达的方法进行鉴定.结果是下游的eGFP基因在PGK1启动子驱动下,在293FT细胞中表达绿色荧光蛋白报告基因,这表明成功构建了慢病毒表达质粒pL-PGK-GFP.扩增的537bp PGK1启动子片段具有一定的启动效率,能在HIV来源的慢病毒载体中驱动下游目的基因的表达.     

LITAF基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：探讨构建人脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子(LITAF)基因的过表达慢病毒载体的技术方法并检测其体外表达目的基因的水平。方法：设计LITAF基因引物,应用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增LITAF基因片段,应用EcoRI、BamHI酶切LV8载体,通过连接酶将LITAF基因片段连接至线性化的LV8载体上,应用酶切及测序方法鉴定LITAF-LV8重组质粒。将其包装慢病毒后感染293T细胞(人胚肾细胞),观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,验证后感染肝癌细胞株HepG2。RT-PCR和Western-blot鉴定感染后HepG2中LITAF的表达。结果：LITAF基因在慢病毒感染的HepG2细胞中的表达显著高于对照组细胞。结论：成功构建了过表达LITAF的HepG2细胞株,为后期研究提供了实验基础。     

MiR-218慢病毒表达载体的构建及鉴定

摘要:构建人mir-218-2, pre-miRNA慢病毒表达载体,为研究miR-218在人体的功能及作用机制打下基础。以人hsa-mir-218-2前体序列,设计部分互补的正反向引物,进行引物退火,形成引物二聚体,PCR扩增引物二聚体,酶切后插入到线性化pGCSIL-GFP慢病毒表达载体中,对重组质粒进行双酶切鉴定,并进行慢病毒的包装与滴度检测。用构建好的慢病毒表达载体感染人胃癌细胞MKN-28,qPCR检测细胞内miR-218表达。结果显示,重组质粒经双酶切分析及转化菌液测序,插入序列正确,慢病毒表达载体感染人胃癌细胞后qPCR检测显示能显著增高miR-218的表达。说明本实验成功构建了hsa-mir-218-2慢病毒表达载体,感染人胃癌细胞后能有效提高miR-218的表达。为进一步研究miR-218在人体的功能及作用机制建立了实验基础。     

小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定

构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具。利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成法合成小鼠Sirt3基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建慢病毒表达质粒。进行酶切及测序验证后,将慢病毒表达质粒连同辅助包装原件载体质粒共同转染入293T细胞,收集上清,测定病毒滴度。用Sirt3基因过表达慢病毒感染SK-N-SH细胞,即为Sirt3过表达组(Sirt3);用空载体慢病毒感染的SK-N-SH细胞为空载体组(GFP);未感染病毒的SK-N-SH细胞为对照组(CON)。收集细胞后,用Real-time PCR法检测各组细胞Sirt3 mRNA的水平;用Western blotting法检测各组细胞Sirt3蛋白的表达。Sirt3基因过表达慢病毒载体构建成功,病毒滴度为1.0×10~9TU/m L。Sirt3组SK-N-SH细胞的Sirt3 mRNA和Sirt3蛋白水平均显著高于GFP组和CON组(P0.01)。成功构建的Sirt3基因过表达慢病毒载体具备高效感染力,能在SK-N-SH细胞高效过表达Sirt3,本研究结果为今后进一步在神经细胞和模型动物中研究Sirt3的作用提供了新的途径和工具。     

基于Cre-LoxP系统的新型慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的构建与鉴定

目的:基于Cre-Lox P系统构建携带EGFP及Puromycin抗性基因,并带有巨细胞病毒(CMV)及翻译延伸因子1α(EF1α)双启动子的新型慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒载体系统.方法:以已经插入Lox P序列的p LOX-TERT-ires TK慢病毒载体为模板,用Spe I与Kpn I进行双酶切,去除TERT-ires TK片段,然后与人工设计合成的多克隆位点片段连接,构建p LOX-MCS表达载体.同时,以p B513载体为模板扩增EF1α-EGFP-Puro表达框(带有Bam HI及Kpn I酶切位点),然后与经过Bam HI及Kpn I双酶切的p LOX-MCS载体连接,进而构建p LOX-CMV-EF1α-EGFP-Puro(简称p LOX-CMV-E/P)载体.将p LOX-CMV-E/P载体与慢病毒包装载体p CMVR8.74及p MD2.G共转染293T细胞,包装病毒进行报告基因的功能分析.结果:菌落聚合酶链式反应(PCR)、酶切鉴定及测序结果均与预期结果一致,绿色荧光蛋白及抗药性基因均有较好的活性与功能.结论:成功构建了p LOX-MCS及p LOX-CMV-E/P慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒表达系统.     

脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

探讨构建人脂多糖诱导肿瘤坏死因子释放因子(LITAF)基因的过表达慢病毒载体的技术方法,并检测其体外表达目的基因的水平。设计LITAF基因引物,应用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增LITAF基因片段;应用EcoRI、Bam HI酶切LV8载体,通过连接酶将LITAF基因片段连接至线性化的LV8载体上,应用酶切及测序方法鉴定LITAF-LV8重组质粒,将其包装慢病毒后感染293T细胞(人胚肾细胞),观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,验证后感染肝癌细胞株HepG2。RT-PCR和Westernblot鉴定感染后HepG2中LITAF的表达。LITAF基因在慢病毒感染的HepG2细胞中的表达显著高于对照组细胞。说明成功构建了过表达LITAF的HepG2细胞株,为后期研究提供了实验基础。     

慢病毒介导的外源基因在人牙髓干细胞中的表达

牙髓干细胞（dental pulp stem cells,hDPSC）是牙源性的间充质干细胞,具有多向分化潜能.已有的研究表明,一些蛋白因子能够诱导牙髓干细胞的牙向分化,但尚无通过过量表达某些关键基因来诱导牙髓干细胞牙向分化的报道.利用绿色荧光蛋白作为报告基因,探究慢病毒介导的外源基因在牙髓干细胞中的表达,分离并鉴定人的恒牙牙髓干细胞,用携带绿色荧光蛋白标记的慢病毒原液感染DPSC,感染病毒后的DPSC进行传代以验证外源基因的稳定表达,并将感染慢病毒后的DPSC与羟基磷灰石/磷酸三钙（hydroxyapatite/tricalcium phosphate,HA/TCP）混合移植到小鼠肾囊膜下培养8周.结果表明：用绿色荧光蛋白标记的慢病毒能够整合到牙髓干细胞的基因组中并获得稳定的表达,感染慢病毒前后的牙髓干细胞增殖率没有发生改变,感染病毒的hDPSC与HA/TCP混合移植到肾囊膜下仍能够产生牙本质牙髓样结构,因此利用慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白并不影响牙髓干细胞的生物学特性,说明在进一步利用慢病毒载体研究过量表达基因在牙髓干细胞牙向分化的作用中,绿色荧光蛋白可以作为标记蛋白.     

GGPPS基因干扰腺病毒载体的构建及鉴定

构建GGPPS基因干扰腺病毒质粒载体并加以鉴定.根据GGPPS基因序列设计GGPPS干扰序列引物,定向克隆至穿梭载体pshuttle-H1的BglⅡ和HindⅢ位点,PmeⅠ酶切线性化的pShuttle-H1-SiGGPPS干扰质粒,并与腺病毒载体(pAdEasy-1质粒)共同转化E.coli BJ5183感受态细菌,产生重组腺病毒载体.用PacⅠ酶切线性化的回收质粒,转染293A细胞包装腺病毒颗粒,在倒置显微镜下观察细胞CPE,用TCID50法测定病毒颗粒的浓度,并初步观察病毒感染PC12细胞对目的基因的干扰效率.经酶切鉴定、测序证实成功构建GGPPS基因干扰腺病毒载体.包装的腺病毒浓缩悬液滴度为1.995×107PFU/mL.GGPPS在人中具有保守性,该病毒能在人源的WRL-68细胞中成功表达,并且对GGPPS基因干扰效率达70%以上.     

Npas4基因过表达慢病毒的构建及其在SK-N-SH细胞的表达

研究旨在构建Npas4基因过表达慢病毒,为进一步深入探索Npas4基因的功能奠定基础。用人工合成大鼠Npas4基因c DNA片段,将其插入p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP构建慢病毒表达质粒p CDH-Npas4。酶切、测序验证质粒后,将p CDHNpas4和辅助质粒共转染包装细胞293T,浓缩上清得病毒颗粒并测定病毒滴度。取病毒颗粒感染SK-N-SH细胞48 h,收集细胞采用Western blotting法检测Npas4蛋白的表达。p CDH-Npas4携载正确Npas4基因,将其包装293T细胞后能产生病毒。病毒滴度为1.05×109TU/m L。相比于转染GFP病毒对照组(GFP)和未转染对照组(control),Npas4重组慢病毒组(Npas4)的细胞Npas4蛋白表达显著增高。成功构建Npas4基因过表达的重组慢病毒载体p CDH-Npas4,并获得高效的重组慢病毒,能将外源Npas4基因导入SK-N-SH细胞,为进一步研究Npas4基因的相关功能奠定了基础。     

慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究

主要就慢病毒载体及其介导的RNA干扰技术在基因治疗中的应用研究进行了综述,并对其在该领域具有的广阔前景进行了展望.慢病毒载体作为一种新型的载体,可有效地将携带的目的基因导入宿主细胞,并将其整合到宿主细胞基因组中,从而使目的基因得以持久稳定地表达.该载体因具有高感染性、高表达效率及不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为基因治疗研究中的一个重要工具.RNA干扰技术可以特异性抑制或关闭特定基因的表达,因此该技术可广泛应用在基因功能探究和恶性肿瘤治疗等领域.由慢病毒载体介导的RNA干扰技术能持久、稳定、特异性地抑制各类细胞中特定基因的表达,在病毒感染、肿瘤等疾病的基因治疗中被广泛应用,成为生物医学领域的新热点.     

Expression of human clotting factor Ⅸ mediated by recom- binant lentiviral vector in cultured cells and hemophilia B mice

To explore the expression of human clotting factor Ⅸ (hFⅨ) cDNA in vitro and the feasibility of gene therapy for hemophilia B mice mediated by recombinant lentiviral vector, a recombinant hFⅨ lentiviral vector driven by ubiquitin-C promoter, FUXW, and by ABP liver specific promoter, FAXW, was constructed respectively. Recombinant lentivirus was harvested from 293T cells by calcium phosphate-mediated transient cotransfection of three plasmids (transgene vector, CMV腞8.2, VSV-G). hFⅨ expression was detected in supernatant of 293T, BHK and L-02 cells infected with FUXW virus, whereas higher expression of hFⅨ levels (630 ng/106 cells/48 h) was detected only in L-02 cells infected with FAXW virus. Serum hFⅨ antigen was detected in all hemophilia B mice treated with FAXW virus by tail vein injection, an efficiency level of hFⅨ was observed (45 ng/mL, approximately 1% of normal human levels), the expression lasted for more than 60 d. The results indicated that HIV-based lentiviral vectors offer a promising approach to the gene therapy of hemophilia B.     

DLL3蛋白在人小细胞肺癌细胞中的功能及其机制

为探讨DLL3(human notch ligand delta-like 3)过表达对人小细胞肺癌细胞的影响及可能的作用机制,通过PCR方法扩增人DLL3基因全长序列,并克隆至慢病毒表达载体Lenti-EFS-FLAG-puro而构建人DLL3基因过表达慢病毒表达质粒,酶切及测序鉴定质粒正确。通过慢病毒包装及感染,构建DLL3稳定过表达的人小细胞肺癌细胞株,并通过Western blot验证DLL3蛋白的表达。采用CCK-8法检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖的影响。采用平板克隆实验检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的克隆形成的影响。Western blot检测DLL3过表达对细胞周期相关蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平的影响。结果表明:人DLL3过表达慢病毒表达质粒构建成功; CCK-8实验显示DLL3过表达促进人小细胞肺癌细胞的增殖。平板克隆实验显示DLL3过表达提高人小细胞肺癌细胞的克隆形成能力。Western blot结果表明DLL3过表达增加细胞周期蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平。可见DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖具有促进作用。     

BGC-823细胞中慢病毒途径针对HIF-1α基因的RNAi实验

目的：构建人HIF-1α基因的shRNA慢病毒载体、包装生产重组慢病毒颗粒,病毒途径高效感染胃癌细胞株BGC-823,并验证基因沉默效率。方法：在NCBI数据查找人HIF-1α基因序列,然后使用siRNA在线设计软件,设计针对基因CDS区的3条siRNA序列及Negative序列。根据设计好的siRNA序列设计双链互补的shRNA-Oligo DNA,退火形成双链后与线性化载体链接,构建shRNA重组表达载体。经由293TN细胞包装shRNA重组慢病毒颗粒,随后使用重组病毒感染BGC-823,通过荧光标记蛋白GFP确定感染效率后收集细胞样本,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：shRNA重组表达载体测序结果与设计序列完全一致,包装病毒后滴度达到1×104 ifu/μL。慢病毒感染BGC-823细胞取得了极高的基因转导效率。mRNA检测结果显示,siRNA3对于对与目的基因的沉默效果最好,较阴性对照序列组相比较,mRNA的表达量下降了92%,Western blot检测的结果与mRNA检测结果完全相符合。结论：通过慢病毒途径,可以在BGC-823细胞中高效的进行HIF-1α基因的沉默。     

慢病毒介导的HPV16-E7基因RNAi细胞模型的建立

 建立HPV16-E7基因的RNAi细胞模型,可为进一步研究HPV16-E7蛋白作用及致癌机制提供物质前提。选择HPV16-E7基因特异的siRNA片段,构建慢病毒siRNA重组表达载体,经293FT病毒包装细胞转染产生重组病毒,并以此感染HPV16阳性SiHa宫颈癌细胞、抗菌素筛选和分子生物学鉴定,建立了稳定表达HPV16-E7-siRNA的RNAi细胞模型。该细胞模型,对目标基因（E7）表达的抑制效率,也以蛋白免疫印迹和RT-PCR确证。由此得出,利用慢病毒载体和HPV16-E7基因特异的siRNA片段,可以建立一种稳定、有效和可行的RNAi细胞模型,为进一步研究E7蛋白的作用及致癌机制奠定了重要的物质基础。     

慢病毒载体转染犬睾丸生殖细胞

摘要: 目的观察慢病毒载体( Lentiviral vector,LV) 对犬生殖细胞的转染,为基于LV 的精子介导法制备转基因动 物提供依据。方法采用睾丸打点注射法,向比格犬两侧睾丸分别注入滴度为5 × 108、1 × 108、2 × 107 TU /mL 的 慢病毒液组成3 个剂量组,每点注射量为每只犬0. 2 mL。于注射后第2 周开始采集精液,通过精液DNA 的PCR 检 测和精子荧光镜检评估绿色荧光蛋白( green fluorescent protein,GFP) 基因的整合及表达。结果1) 在高剂量组,整 合并表达GFP 基因的精子于第4 周首现并持续至第17 周; 在中、低剂量组于第5 周首现,分别持续到第14 周、12 周。2) GFP 表达的高峰期在注射后第7 周～ 10 周。3) GFP 表达于整个精子,以顶体后区和精子尾颈部表达最强。 4) 注射后第2 周～ 6 周,中剂量组犬采精困难,高低剂量组犬精子畸形率有上升的趋势。5) 在GFP 表达的高峰期, 绿色荧光精子的百分率在高、中、低剂量组分别为43. 33% 、35. 53% 和4. 55% ,具有明显的差异。结论基于LV 的 精子介导转基因法( Sperm-mediated gene transfer,SMGT) 可成功获得转基因犬精子,转基因阳性率、表达的强度与 持续时间与慢病毒滴度相关。