茄青枯假单胞菌T2015致病相关基因突变体的构建

分离自花生植株的茄青枯假单胞菌(Ralstonia solanacearum)T2015的Tn5-lacZ插入突变体T2135是极性突变体.采用现代分子生物学实验技术,首先构建了同一操纵子中ORF2的表达质粒pGX6191,并进行生物学验证,然后采用三亲本结合技术导入极性突变体T2135,得到茄青枯假单胞菌T2015中与致病相关基因ORF3的突变体T2135/R.     

茄假单胞菌寄生花生特异性毒性基因的定位

通过对从茄假单胞菌中克隆的ｐＧ-１２５２进行亚克隆分析，发现含ｐＧＸ１２５２右边 ４．５ｋｂＫｐｍＩ／ＥｃｏＲＩ片段的亚克隆ｐＧＸ１４０４仍象ｐＧＸ１２５２一样能使对花生不致病菌株Ｔ２０１４在花生上致病，用转座子Ｔｎ５－ｌａｃ对ｐＧＸ１４０４进行了饱和插入诱变，一共分离得到６个在ｐＧＸ１４０４上不同位置的独立插入突变其中离ｐＧＸ１４０４右末端的１．４ｋｂ、２．２ｋｂ的两个Ｔｎ５－ｌａｃ插入使ｐＧＸ１     

茄假单胞菌寄主花生特异性毒性基因的定位

通过对从茄假单胞菌中克隆的pGX1252进行亚克隆分析,发现含pGX1252右边4.5kbKpnI/EcoRI片段的亚克隆pGX1404仍象pGX1252一样能使对花生不致病菌株T2014在花生上致病.用转座子Tn5-loc对pGX1404进行了饱和插入诱变,一共分离得到6个在pGX1404上不同位置的独立插入突变,其中离pGX1404右末端约1.4kb、2.2kg的两个Tn5-loc插入使pGX1404丧失了扩大T2014寄主范围的能力,证实hsv基因位于pGX1404的右边.     

抑制姜瘟青枯假单胞菌的木霉菌株的筛选及其抑菌机理

筛选得到一株可有效抑制姜瘟青枯假单胞菌的木霉菌株SMF2(Tricoderma spp SMF2)，证实其胞外分泌的抗生素--木霉素是抑制姜瘟菌生长的主要物质，该物质对热稳定，固体发酵是培养木霉制剂的有效方法，并对培养基的组成、培养条件进行了初步优化。     

铜绿假单胞菌耐药机理

铜绿假单胞菌是耐药性十分突出的一类院内感染条件致病革兰氏阴性细菌．本文从生物被膜、细胞密度依赖式毒力因子、外排系统、基因盒一整合子系统及铜绿假单胞菌噬菌体几方面对其耐药性机理进行了概述，并提出了未来对微生物耐药性研究和应用的一些策略。     

导入脂肪酶基因提高荧光假单胞菌26-2的产酶效率

采用导入脂肪酶基因的方法对荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescence）26—2的产酶效率进行实验。实验以质粒ppic9k—lipA为模板,通过PCR的方式在26—2脂肪酶基因的两端引入BamHl和EcoR1的酶切位点,并将该基因与大肠杆菌荧光假单胞菌穿梭质粒pDSK 519连接,获得重组质粒pDSK519-lipA,再将重组质粒转入荧光假单胞菌26—2,获得工程菌株P．fluorescence 26—2—1。在相同的发酵条件下,工程菌株的发酵液酶活力比原始菌株的发酵液酶活力提高2倍,实现了荧光假单胞菌脂肪酶基因的同源性表达。     

紫外线对番茄青枯菌致病性变化的影响

紫外线的亚致死剂量、致死剂量对青枯雷尔氏菌作用的实验表明:亚致死剂量照射不同时间对青枯雷尔氏菌强致病力菌株有不同程度地促进作用,而无杀灭作用及任何抑制和致弱现象;致死剂量照射对强致病力菌株和无致病力菌株影响不同,结果差异极显著,无致病力菌株对紫外线的耐受力要高于强致病力菌株.致死剂量紫外线对强致病力菌株处理2min,抑制率即达100%,致弱率为0;无致病力菌株照射2min与4min的处理,抑制率分别为70.3%和96.3%,处理8min以上,抑制率达100%.     

青枯菌SRAP—PCR体系的建立与优化

本研究以马铃薯青枯菌19046为试验材料,应用单因素试验法优化SRAP—PCR反应体系,得出重复性好、带型清晰、稳定性强的最佳反应体系：总体积为10μL,50．g／μL模板DNA0．6μ、10μmol／L引物0．8μL、TapDNA聚合酶1．0U、10mol／L、dNTPs1．0μL．该反应体系可用于青枯菌遗传多样性、基因定位与克隆等的研究．     

植物青枯菌检测方法研究进展

细菌性青枯病是由青枯菌引起的一种植物毁灭性病害,在世界各地都有不同程度的分布.在介绍青枯菌种内分类状况的基础上,重点对青枯菌的检测方法包括传统分离培养法、免疫学技术和分子生物学方法等进行了概括,比较了这些方法在应用中的优缺点,并对青枯菌检测方法的选择进行了探讨.     

蜡状芽孢杆菌对番茄青枯雷尔氏菌致病性的影响

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）从其致病性上可分为能使植株发病的强致病力菌株和不能使植株发病的弱致病力菌株．利用蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）与致病性稳定的青枯雷尔氏菌强致病力菌株进行共培养，处理后的青枯雷尔氏菌在TTC平板上表现为弱毒株的菌落特征，出现了致弱现象．经过16S rDNA基因序列测定，证明了用蜡状芽孢杆菌处理前后的菌株为青枯雷尔氏菌，并非是其它的污染菌株，通过回接番茄盆栽苗发现致弱前的青枯雷尔氏菌能有效引起番茄发生青枯病，而致弱后的菌株丧失致病力．不能引起番茄发病，     

青枯雷尔氏菌龙胆酸1,2-双加氧酶基因的克隆、表达和酶性质的研究

本研究克隆、表达了青枯雷尔氏菌GMI1000菌株中编码龙胆酸1,2-双加氧酶的基因, 并通过亲和层析对该酶进行了纯化, SDS-PAGE结果表明该酶亚基约为38kDa.该酶的最适反应温度和最适pH分别为30℃和7.5.该酶的Km为56μmol/L,pI为4.6～4.8.纯化后的龙胆酸1,2-双加氧高度不稳定:4℃下放置72h即失去85%的酶活. 甘油和β-巯基乙醇可稳定该酶酶活,在添加10%(体积比)甘油至酶液(50mmol/L, pH 7.3的磷酸盐缓冲液保存)后,-20℃保藏2周后均能检出明显的酶活.0.1～1mmol/L Fe2 可以激活或者稳定该酶的酶活.Na ,K ,Mg2 和Ca2 (分别为1～2mmol/L)对该酶的酶活无明显的影响.Mn2 ,Zn2 和Fe3 的添加量超过2mmol/L时,酶活急剧下降.1mmol/L的Cu2 即使该酶失去酶活.     

超声波对番茄青枯雷尔氏菌致病性变化的影响

用频率为40kHz,功率为250W的超声波处理野生型番茄强致病力青枯雷尔氏菌F.1.3 010703 01,结果表明:在5、10和20min的处理出现3.24%～5.54%的抑制率,而在15和25min的处理出现-1.04%～-2.82%的抑制率;强致病力菌株的弱化指数在0.4461～0.5376之间,强致病力菌株所占的比例在95.83%～96.14%之间;超声波处理不同时间的菌株回接番茄组培苗,回接发病率皆为100%;处理组与对照之间无极显著性差异(P≥0.01).表明处理菌株保持着强致病力菌株的特性.作为一种机械能量形式,超声波对番茄青枯雷尔氏菌F.1.3 010703 01的生长和致病力都没有影响.作为一种物理致弱因子,超声波对青枯雷尔氏菌无致弱作用.     

番茄青枯雷尔氏菌的强致病力与无致病力菌株生长竞争关系的研究

在单独和混合培养条件下,研究了番茄青枯雷尔氏菌的强致病力(RV)与无致病力菌株(RA)的生长能力的差异.单独培养时,24h前无致病力菌株的菌体生长量超过强致病力菌株,24h后强致病力菌株菌体生长量超过无致病力菌株,12h时无致病力菌株的生长速率是强致病力菌株的5.6倍,60h时无致病力菌株的菌量仅为强致病力菌株的0.37倍.混合培养时,混合比例RV RA<1时,两种菌株都呈正增长,但后者比前者增长快,当混合比例RV RA≤1时,强致病力菌呈负增长(-119.57%～-33.57%),无致病力菌呈正增长(84.50%～285.50%).随着RV RA值升高,增长率呈升高的趋势.上述结论表明:无致病菌株在一定的时间内具有高于强致病力菌的生长能力,当与强致病力菌混合时,能较快成为优势种群,这可能是人工大量施用无致病力菌株时,能有效地保护番茄植株在生长初期免受青枯病的危害,在短期内起到一定的防治效果的原因所在.但随着时间的延长,强致病力菌株又重新成为优势种群,这可能是导致无致病力菌防效下降的原因之一.     

拮抗烟草青枯病菌的烟草内生细菌系统多样性及趋化性分析

 从来自3个烤烟品种NC297、红大、K326的600株内生细菌中,以烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)为靶标,共筛出55株拮抗菌,其对烟草青枯病菌的抑菌圈直径在1~16 mm之间.对这55株拮抗性内生细菌的16S rRNA基因序列进行RFLP分析共产生6种带型.根据RFLP带型选取16株进行16S rRNA基因序列测定和系统发育分析.结果表明这55株拮抗性内生细菌属于Firmicutes和Proteobacteria两大类群的6个种:Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum,Bacillus methylotrophicus,Bacillus tequilensis,Brevibacillus parabrevis,Brevibacillus brevis和Pseudomonas aeruginosa.利用cheA基因检测方法和平板检测方法共筛选到3种具有趋化性的拮抗性内生细菌:Brevibacillus parabrevis,Brevibacillus brevis和Pseudomonas aeruginosa.     

青枯雷尔氏菌HPLC分析中色谱分离条件的研究

研究了在青枯雷尔氏菌的高效离子交换色谱(HPLC)分析中,不同色谱分离条件对分离效果的影响.建立了在室温下分离青枯雷尔氏菌的最佳色谱条件:采用Toyopearl SuperQ-650C强阴离子交换树脂、0.02mol/L哌嗪-HCl缓冲液(pH 8.0)、洗脱盐浓度为1 mol/L NaCl、洗脱梯度0~75%/30 min、流速1 mL/min.在该色谱条件下,可获得良好分离的3个青枯雷尔氏菌色谱峰.