MAPK信号通路在卵母细胞减数分裂中的作用

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一类广泛存在于真核细胞中的Ser/Thr蛋白激酶，在卵母细胞减数分裂过程中起重要调节作用，MAPK的激活涉及一系列蛋白激酶的级联活化。p90^rsk是MAPK宾重要底物，介导MAPK的大部分生物活性。MAPK在减数分裂的G2／M转化期被激活，在MI期达到活性高峰，并维持这一水平直至受精以后、原核形成以前。MAPK与MPF在减数分裂调工过程中具有复杂的相互作用。另外，其他信号转导途径，加cAMP信号通路、蛋白激酶C信号通路以及蛋白磷酸酶等，都在卵母细胞减数分裂的不同时期调节着MAPK的激活。结合自己的工作，对MAPK与减数分裂的研究进展进行了评价和展望。     

人类体细胞克隆胚的构建

人类体细胞克隆胚的构建是治疗性克隆的基础和前提. 将供体细胞核注射到成熟卵母细胞, 然后用钙离子载体(A23187)和6-甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活卵母细胞. 在卵母细胞活化并出现原核样核(2PN)后, 去掉雌原核而保留供体细胞核, 避免了去核时对卵母细胞进行DNA荧光染色和紫外线照射, 同时也避免了去除过多的细胞质. 经体外培养后, 有少量核移植胚发育到囊胚阶段.     

低氧培养早期胚胎克隆小型猪(Sus Scrofa)

猪的体细胞克隆在人类的异种器官移植方面有着巨大的应用前景. 以中国实验用小型猪胎儿成纤维细胞为核供体, 从屠宰场采集初情期前母猪的卵巢, 卵母细胞体外成熟后去核构建克隆胚胎, 重构卵电融合并激活, 在7% O₂, 5% CO₂及88% N₂的气相条件下NCSU-23或PZM-3培养基培养. 给3头代孕母猪移植230枚克隆胚胎, 其中一头妊娠足月并产下3头仔猪, 生产克隆猪的效率达到1.3%; 其中一头健康状况良好, 存活至今, 毛色及DNA微卫星遗传分析证实为克隆个体. 以上结果表明, 利用初情期前母猪的卵母细胞, 克隆胚胎培养在低氧条件下, 是生产克隆猪的一条有效途径.     

猪卵泡内促卵丘扩展因子的来源

猪卵丘的扩展不依赖于卵母细胞，因此推测，猪卵母细胞可能不是卵泡内促卵丘扩展因子（cumulus expansion enabling factor,CEEF)的惟一来源，实验应用小鼠摘除卵母细胞的卵丘－卵母细胞复合体（oocytectomized complex,OOX)检验猪透明带，不同质量生发泡期卵母细胞以及卵泡内的其他细胞成分产生CEEF的情况，结果证明：（1）猪和小鼠控透明带都不能产生CEEF。（2）猪不同质量（A，B，C三类）未成熟卵母细胞均能分泌CEEF，其分泌CEEF的能力和CEEF活性没有明显差异（P＞0．05），（3）猪3－6mm卵泡的OOX和小于1mm卵泡的颗粒细胞都有较高的CEEF分泌能力，且此能力不依赖于激素作用。但3－6mm卵泡的壁颗粒细胞不能分泌CEEF，（4）3－6mm卵泡的卵泡液中含有CEEF，但其活性与培养时所用的卵泡液浓度有关，浓度过高CEEF活性反而下降，（5）进行培养时必须添加促性激激素小鼠OOX才发生扩展，说明由猪卵母细胞和卵泡成分产生的CEEF的促卵丘扩展作用依赖于促性腺激素。     

人卵巢未成熟卵母细胞体外成熟及受精的研究

体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET,简称IVF)技术已经建立.但是,目前IVF技术主要适用于能够进行超排卵的病人,对于绝经期过早或卵巢发育不全及生殖障碍的妇女、经过放疗或化疗后的年轻妇女、对超排卵治疗长期无反应者、X-连锁遗传病及常染色体显性遗传病都需要卵子的捐献.成熟卵子的捐献来源还十分困难.学者们设想如果能把人未成熟卵母细胞在体外培养至成熟状态从而建立卵子库,将具     

以胚胎干细胞为核供体能促进异种重构胚的体外发育

体细胞在异种成熟的去核卵母细胞中能够去分化和重编程,并能发育到囊胚,甚至能全程发育正常出生。为了评价胚胎干细胞作为供核细胞在异种动物克隆中的意义,以小鼠胚胎干细胞（ES）为核供体,兔成熟的去核卵母细胞为受体构建异种重构胚,分析其在体外的发育能力,并以小鼠胚胎成纤维细胞和成年小鼠外耳皮肤的成纤维细胞为对照。通过核移植的方法分别把3种细胞移入成熟的兔去核卵母细胞透明带下,经电融合和激活后,在体外培养,胚胎干细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚在体外发育到囊胚的比例为16.1％,明显高于用成年小鼠外耳皮肤成纤维细胞（0％～3.1％,P<0.05）和小鼠胚胎成纤维细胞（2.1％～3.7％,P<0.05）所构建的异种重构胚的体外囊胚发育率.重构囊胚细胞经染色体分析,证实其染色体来源于小鼠胚胎干细胞。以上结果显示,用胚胎干细胞作为供核细胞,比体细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚更容易进行重编程,并且胚胎干细胞指导异种克隆胚胎正常发育的能力强于体细胞。     

体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪

体细胞核移植转基因动物制作路线是目前生产转基因家畜的最佳方法. 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)转基因猪研究可以为转基因家猪育种、人类疾病模型和人类异种器官移植研究奠定良好的基础. 本研究对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选, 以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体, 以体外成熟卵母细胞为核受体, 构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎, 并对重构胚在体外和体内发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究. 结果显示, 采用4.0 μL/mL脂质体转染试剂, 1.6 μg/mL质粒DNA, 转染6 h可以获得最佳的转染效果, 转染效率达3.61%; GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%, GFP阳性胚胎率为48%; 重构胚移植于10头受体后, 有5头妊娠, 3头受体发育到期, 共出生克隆猪6头, 其中4头为GFP阳性, 经DNA检测确认为GFP转基因猪; 转基因克隆胚胎移植出生率为1.0%, 阳性个体出生率为0.7%. 结果表明, 脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞, 获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能. 本研究对我国体细胞克隆转基因猪的研究具有重要的参考价值.     

卵丘细胞产生的一氧化氮促进小鼠卵母细胞的成熟

采用体内注射一氧化氮合酶(NOS)抑制剂左旋硝基精氨酸甲基酯(L—NAME)和在体外培养基中分别加入L—NAME或次黄嘌呤以抑制卵母细胞自发成熟的3种模型，研究了一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)对小鼠卵母细胞体内、外成熟的促进作用。结果表明，只有腹腔注射2.5mg／kg SNP这一剂量组能显著逆转10mg／kg L—NAME对卵母细胞第一极体(PB1)释放的抑制作用(P＜0.05)，而高剂量SNP(10mg／kg)使小鼠在注射药物半小时后全部死亡；10^7，10^-6和10^-5mol/L浓度的SNP能显著促进由4mmol/L次黄嘌呤抑制的卵丘卵母细胞复合体(CEO)中卵母细胞的体外成熟、而10^-3、10^-4,10^-8mol/L SNP对CEO中卵母细胞的体外成熟无影响；最适浓度的SNP(10^-5)和10^-6mol/L)不影响裸卵(DO)的体外成熟；10^-3mol/L L—NAME能显著抑制CEO PB1的释放，但对生发泡破裂(GVBD)无影响、而10^-5mol/L SNP能显著逆转其抑制．结果提示，卵丘细胞产生的生理剂量的NO可以促进体内、外卵母细胞的成熟。     

p14ARF高表达对γ射线诱导的人黑色素瘤细胞凋亡的影响

抑癌因子ARF可以激活p53诱导细胞周期的阻断或凋亡.为阐明ARF在促进细胞凋亡作用中的分子机理,建立了高表达p14~(ARF)的人黑色素瘤A375细胞模型.实验表明,p14~(ARF)高表达能促进p53富集在细胞核.经γ射线照射后,发现pI4~(ARF)高表达能促进A375细胞凋亡,促使Smac从线粒体释放到胞质中,p53,Bax,Caspase-3,Caspase-9,p21~(cipl)和p27~(kipl)蛋白水平明显提高,而Bcl-2和磷酸化的ERK蛋白水平下降.提示γ射线辐照下,p14~(ARF)促进A375细胞凋亡是ERK介入的依赖p53的以线粒体为核心的凋亡途径.     

v-fos转化效应因子是CD2胞内区新的结合蛋白

在以前的研究中, 本实验室采用酵母双杂交技术, 从人KT3 T淋巴细胞cDNA文库中筛选到一个与CD2胞内区结合的新的蛋白分子, 称为v-fos转化效因子(v-fos transformation effector, Fte-1). 本研究进一步分析鉴定了Fte-1与CD2相互作用的分子机制和Fte-1的生物学功能. 应用研究生物大分子相互作用的生物传感器分析了CD2胞内区与Fte-1结合特性和亲和力, 表明二者确为特异性结合, 其解离常数K_D值为10^-7 mol/L; 分子缺失突变和体外磷酸化实验结果表明, Fte-1可被蛋白激酶C(PKC)磷酸化, 其磷酸化位点为Ser238; 基因表达研究显示, 在Jurkat T淋巴细胞白血病细胞中Fte-1呈簇集性分布; CD2单克隆抗体T11刺激Jurkat T淋巴细胞后, Fte-1这种簇集性分布特征消失, 而趋向细胞膜, 并与 CD2共定位于细胞膜区域; Fte-1的PKC磷酸化位点Ser238突变为Gly238后, 其与CD2分子的共定位能力丧失, 表明Fte-1的Ser238的PKC磷酸化对Fte-1和CD2在T淋巴细胞内的结合起关键作用; 使用Fte-1干扰RNA技术抑制Fte-1在Jurkat T淋巴细胞中的表达, 可抑制佛波酯(PMA)和离子霉素(ionomycin)引起的Jurkat T淋巴细胞激活后凋亡, 提示Fte-1参与了CD2对T淋巴细胞凋亡的调节. 上述结果进一步确证Fte-1是CD2胞内区的特异结合蛋白, 并可能参与了CD2介导的细胞凋亡信号传递.     

电活性生物膜生长过程中电荷与传质阻抗的变化规律

电活性生物膜因为能直接向胞外产生电子,将生物能直接转化成电能,所以近年来已经成为国际领域内的研究热点.在电活性生物膜内部,一方面存在着复杂的生物电化学过程,另一方面微生物及生物膜生长又涉及复杂的质量传递过程.本文针对电活性生物膜不同生长阶段的质量传递损失和电荷传递损失展开研究,以期找到在不同时期内其产能的限制因素,这将对于电活性生物膜性能的改善具有至关重要的作用.本研究结果表明,80 h时,电荷传递阻抗占总内阻的99.8%.因此在电活性生物膜运行初期,电荷传递阻抗成为限制其产能的主要因素.随着运行时间的增长,电荷传递阻抗的比例不断下降,430和460 h时分别为86.9%和72.9%.运行到500 h后,电荷传递阻抗的比例下降到33.1%.然而此时,传质阻抗的占比上升到38.6%.因此当电荷性生物膜逐渐成熟时,电荷阻抗和传质阻抗共同成为其产能的限制因素.因此在电活性生物膜不同生长阶段,采用不同的方法来降低其对应的内阻对提高产电性能至关重要.     

不同类型核受体对小鼠体细胞重构胚胎发育能力的影响

为探讨昆明白小鼠不同类型的卵胞质对小鼠体细胞核移植胚胎发育的影响, 采用C57BL/6小鼠耳成纤维细胞为核供体, 昆明白小鼠卵母细胞为核受体进行单次核移植, 同时采用将重构胚类合子核移入去核合子、重构胚2-细胞卵裂球细胞核移入去核MⅡ期卵的方法进行连续核移植, 通过将重构胚2-细胞卵裂球与正常昆明白小鼠2-细胞胚胎卵裂球交换融合得到四倍体胚胎. 对所得胚胎进行体外培养, 结果发现, 以去核的昆明白小鼠MⅡ期卵母细胞为核受体进行单次核移植所得到的重构胚胎发育率很低, 且只能发育到8-细胞阶段. 两种连续核移植重构胚发育率均有所提高, 但仅重构胚类合子核移入去核合子时有囊胚出现, 囊胚发育率为1.9%. 重构四倍体胚胎囊胚发育率却很高(62.3%), 染色体分析表明其中51.5%为真正的四倍体. 结果表明, 昆明白小鼠不同类型核受体对重构胚胎的发育能力有显著影响, 其去核卵母细胞胞质对体细胞核重编程的能力较弱, 而当其与正常受精卵胞质共同作用时可较好地对体细胞核重编程.     

p14ARF高表达对γ射线诱导的人黑色素瘤细胞凋亡的影响

抑癌因子ARF可以激活p53诱导细胞周期的阻断或凋亡. 为阐明ARF在促进细胞凋亡作用中的分子机理, 建立了高表达p14^ARF的人黑色素瘤A375细胞模型. 实验表明, p14^ARF高表达能促进p53富集在细胞核. 经 γ 射线照射后，发现p14^ARF高表达能促进A375细胞凋亡, 促使Smac从线粒体释放到胞质中, p53, Bax, Caspase-3, Caspase-9, p21^cip1和p27^kip1蛋白水平明显提高, 而Bcl-2和磷酸化的ERK蛋白水平下降. 提示γ 射线辐照下, p14^ARF促进A375细胞凋亡是ERK介入的依赖p53的以线粒体为核心的凋亡途径.     

连续核移植对异种克隆大熊猫胚胎发育的影响

异种体细胞核移植为拯求濒危动物提供了一条新的途径,已有的异种核移植报道证明,经休眠处理的体细胞核在异种胞质中能完成早期发育,用处于活跃分裂的大勇猛体细胞作为供核细胞移入去核的兔卵母细胞中,经电融合（融合率为71.6%）及电活化后,体外培养获得了4.2%的囊发育率,为了改善重构胚的发育率,采用连续核移植的方法,即用处于活跃分裂的来源于大熊猫－兔异种重松胚的卵裂球作为供核细胞移入去核兔卵母细胞透明带下,共进行3次连续核移植,核移植融合率分别为79.5%,84.1%和78.0%,与体细胞核移植组无显著差异;经电活化后,体外培养的异种重构胚胎获得了显著高于体细胞核移植组的胚胎发育率,囊胚发育率分别为19.4%,13.5%和10.3%（P＜0.05）。这些结果表明,未经休眠的体细胞核也能支持异种重构胚的早期发育,连续核移植可以提高异种克隆大熊猫重构胚的发育率。     

膜去极化激活的PKC抑制依赖生肌素的AChRγ基因启动子活性

烟碱样乙酰胆碱受体（Acetylcholine receptor,AChR）是由4种亚基组成的五聚体,其表达受神经电活动控制。胚胎期神经植入前,AChR弥散分布于肌细胞表面;突触发生后,突触外AChR表达受抑制,而集中于突触后膜表达。出生后去神经或用特异的Na~ 通道阻断剂阻断电活动可引起骨骼肌组织突触外AChR mRNA明显升高。电刺激去神经的肌肉又可使突触外AChR基因表达关闭。因此,有关膜去极化与AChR基因转录激活的偶联机制研究已成为当前愈发感兴趣的课题。Klarsfeld等利用特异的阻断剂证明,电活动抑制AChR的生物合成涉及Ca~（2 ）和PKC的作用。huang等发现,Ca~（2 ）通过去极化的膜由L型钙离子通道进入胞浆,可引起AChR基因快速失活;膜去极化可引起核内PKC活性升高,进而导致AChR基因表达所必需的1个因子磷酸化而失活。Neville等根据神经和电刺激后基因表达动力     

Chk1防止DNA损伤的S期肿瘤细胞进行异常的有丝分裂

为探讨在p53失活的肿瘤细胞中DNA甲基化试剂引发的DNA损伤对于细胞周期的影响, 我们将同步化在G1, S和G2/M期的HeLa细胞分别进行甲磺酸甲酯(MMS)处理. MMS的处理结果表明, 各个时相的细胞周期进程均发生延迟或阻滞, 其中S期细胞对药物最为敏感. 进一步的分子机理研究表明, 3个时相中ATM-Chk2和p38 MAPK通路均被激活, 但是Chk1仅在S期中被活化, 提示Chk1特异地参与了S期的DNA损伤检查点(DNA damage checkpoint)或者DNA复制检查点(DNA replication checkpoint)的作用. 为了进一步确定Chk1在S期的检查点功能, 用专一的小分子抑制剂抑制Chk1的磷酸化, 发现被MMS处理的S期细胞能在未完成复制的情况下进行异常的有丝分裂, 提示Chk1主要是在HeLa细胞S期的DNA损伤检查点而不是DNA复制检查点发挥其作用. 另外, 本研究还检查了参与G2/M期进程的cyclin B1的表达变化情况. 在MMS处理的S期细胞中, cyclin B1表达量不能上调; 而在加入Chk1抑制剂处理后, cyclin B1则有所增加. 这一结果进一步支持DNA损伤S期细胞在Chk1失活时进入异常有丝分裂的推论. 研究结果表明, Chk1是MMS诱发的HeLa细胞S期DNA损伤检查点的专一性的重要蛋白激酶; 当MMS引发DNA损伤后, 上游蛋白激酶对Chk1进行磷酸化, 从而激活了S期的DNA损伤检查点, 阻止细胞进入G2/M期. 由于这一过程不依赖于p53的活性, 因此Chk1有可能作为p53失活的肿瘤细胞的药物靶标.     

血管内皮生长因子对海绵状血管瘤内皮细胞血管形成的影响

人大脑海绵状血管瘤(CM)是常见的中枢神经系统血管畸形, 深入研究CM内皮细胞的生物学特性及血管形成的细胞与分子机制, 将为寻找治疗该疾病的有效措施提供新的思路. 从手术切除的CM组织分离内皮细胞, 在体外培养扩增. 采用免疫细胞化学染色法检测VEGFR-1和VEGFR-2的表达. 通过MTT法、细胞刮除法和跨膜迁移法以及体外三维Ⅰ型胶原蛋白凝胶模型检测VEGF对CM内皮细胞的增殖、迁移和血管形成的作用. 在非双极电凝切除的25例CM中成功地分离了内皮细胞. 分离的CM内皮细胞具有血管内皮细胞的基本特征, VEGFR-1和VEGFR-2表达比正常人大脑微血管内皮细胞强. 用VEGF处理后, CM内皮细胞的增殖数目、迁移数目、最大迁移距离以及在三维胶原蛋白凝胶中形成毛细血管样结构的长度和面积增大, 与对照组之间的差异有显著性意义. 本研究结果提示, CM内皮细胞的VEGFR-1和VEGFR-2表达上调, VEGF通过与其受体结合激活下游信号通路, 从而促进CM内皮细胞的增殖、迁移和血管形成. VEGF/VEGFR信号途径在CM血管形成方面起着重要调控作用.     

肾上腺髓质素对尾加压素Ⅱ诱导的大鼠血

旨在观察肾上腺髓质素（adrenomedullin,ADM)对尾加压素Ⅱ(urotensin Ⅱ,UⅡ)刺激的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs)内皮素（endothelin,ET)生成的影响，以探讨ADM和UⅡ在血管功能调节中的相互作用。贴块法培养的大鼠VSMCs经10^-8mol/L UⅡ和不同浓度ADM孵育后测定其^3H-胸腺嘧啶（^3H-TdR)掺入、细胞外信号调节激酶（ERK）活性、VSMCs ET mRNA含量和ET生成量。UⅡ（10^-8mol/L)刺激VSMCs ET mRNA含量增加、ET生成、VSMCs^3H-TdR掺入和ERK激活。10^-10～10^-8mol/L ADM以浓度依赖的方式抑制UⅡ刺激的上述效应，与单纯UⅡ组比较，10^-10～10^-8mol/L ADM分别与UⅡ(10^-8mol/L)合用时，VSMCs ET mRNA水平下降15％－45％（均P＜0.01)；培养基中ET含量分别下降为14.13,11.38和11.0pg/mL(均P＜0.01)；10^-9～10^-8mol/L ADM使VSMCs ^3H-TdR掺入分别降低32％（P＜0.05)和41％（P＜0.01)，ERK活性分别降低32％（P＜0.05)和36％（P＜0.05)。单用ADM（10^-8mol/L)对VSMCs ET mRNA含量、ET生成、VSMCs ^3H-TdR掺入和ERK活性均无明显影响。结果提示肾上腺髓质素抑制UⅡ诱导的VSMCs ET mRNA表达和生成，并通过抑制ERK途径抑制UⅡ诱导的VSMCs增殖。     

核移植方法和活化方法对小鼠体细胞克隆胚胎发育的影响

用卵丘细胞为核供体进行小鼠体细胞克隆, 成功获得了一批成年体细胞克隆小鼠. 为探讨不同核移植方法和重构胚活化方法对小鼠克隆胚发育的影响, 用B6D2F1小鼠的卵丘细胞和卵母细胞作为供、受体进行核移植实验, 采用电融合和细胞质内直接显微注射的方法进行核移植, 并采用电脉冲、乙醇处理、氯化锶处理和电脉冲联合氯化锶4种不同方法对重构胚进行活化, 对克隆胚胎的体外及体内发育进行研究. 结果显示, 利用显微注射法获得重构胚胎的工作效率(90.7%)显著高于融合法获得重构胚胎的工作效率(49.7%). 乙醇、电脉冲和氯化锶3种激活方法都可以诱导孤雌胚发育到囊胚, 但前二者处理的胚胎的囊胚发育率(52.4%, 54.2%)显著低于后者(76.9%). 10 mmol/L氯化锶处理6 h活化效果最好. 融合法获得的重构胚经氯化锶或者电脉冲联合氯化锶激活后, 囊胚发育率(9.5%, 8.6%)显著高于单纯电脉冲激活(2.6%), 而乙醇活化的重构胚没有发育到囊胚阶段. 用显微注射法经氯化锶激活获得的重构胚的囊胚发育率最高(16.6%). 注射法和融合法获得的重构胚胎经氯化锶激活后进行胚胎移植, 都获得了发育到期的体细胞克隆小鼠, 发育到期率分别为 2.5%和1.4%. 结果表明, 两种核移植方法对B6D2F1 小鼠重构胚胎的早期发育能力有一定影响, 用这两种方法都可以获得体细胞克隆小鼠; 不同活化方法对重构胚胎的体外发育能力有显著影响, 在上述4种激活方式中, 氯化锶处理对克隆胚的激活效果最好.     

体细胞克隆法生产绵羊转基因囊胚

pEGFP－N1质粒分别转染5只绵羊卵巢原代颗粒细胞,G418筛选后,各取1株阳性转基因细胞作供体,进行绵羊的体细胞核移植（克隆）,共352枚体外成熟的去核卵母细胞与转基因的颗粒细胞进行电融合,得到的329枚核移植胚胎（93．5％）,用Ionomycin／6－DMAP激活,SOFaaBSA液滴体外培养7d,结果显示,312枚核移植胚胎发生卵裂（94．8％）,其中63枚发育至囊胚阶段（19．1％）,随机抽检发现,克隆胚胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因,4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280）,胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因,4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280）,与另外1株未饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率（16．3％,8／49）没有显著差异（P＞0．05）,结果表明,体细胞基因转移和克隆技术的结合,可以有效地生产绵羊的转基因囊胚。