耐热碱性磷酸酯酶基因的亚克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据耐热碱磷酸酯酶基因的酶切图谱和ＤＮＡ序列,分别在基因的起始密友子和终止密码子设计２个突变引物。引物的５‘端分别带有ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切全点。通过ＰＣＲ从质粒ｐＴＡＰ１１８Ｂ中扩增获得了ＦＤ－ＴＡＰ基因的全序列。经过酶切将基因亚克隆于高达载体ｐＪＬＡ５０３。     

A组乙型溶血性链球菌DNaseB基因亚克隆及pET-28a(+)-DNaseB载体构建

运用PCR扩增技术,以质粒pMD18-T-DNaseB为模板,扩增出0.5 kb截短的DNaseB基因,先将该基因片段与pMD19-T载体连接,确定该序列正确并进行大量繁殖后,再将DNaseB基因定向克隆入pET-28a( )表达载体中,构建新的原核表达载体pET-28a( )-DNaseB,转化该重组质粒至受体菌E.coliDH5a中,采用SDS碱裂解法提取该质粒DNA,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和核苷酸序列分析,证实插入的基因片段具有正确的DNaseB基因核苷酸序列,将pET-28a( )-DNaseB转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导其目的蛋白得到了表达.     

江浙蝮蛇毒中性磷脂酶A2的免疫学研究

用江浙蝮蛇毒中纯化的中性磷脂酶Ａ２（ＮＰＬＡ２）免疫家兔，获得了多克隆抗体，抗体与抗原结合后，抑制了该抗原的神经毒性，而对其催化活力无影响，表明ＮＰＬＡ２有两个活性结构域，即神经毒性与催化活性分别位于两个活性位点上，利用免疫亲和层析纯化了ＮＰＬＡ２的多抗，经ＥＬＩＳＡ检测，与酸性ＰＬＡ２和碱性ＰＬＡ２均有免疫交叉反应，这提示了ＮＰＬＡ２与酸性ＰＬＡ２及碱性ＰＬＡ２的抗原决定簇有同源性。     

人C2H2型锌指蛋白基因ZNF194全长cDNA的克隆

用一个含有锌指编码序列的人ｃＤＮＡ片段（Ｌ２￣９）作为探针杂交筛选人肝组织ｃＤＮＡ分子库,得到８个杂交阳性克隆,经测序和拼接后,将其整合为一条长１８３８ｂｐ和ｃＤＮＡ序列,该序列的２２１￣１６４２ｂｐ为一个完整的开放阅读框,编码了一个由４７３个氨基酸组成的蛋白质,１￣２２０ｂｐ为５′－ＵＴＲ,１６４３￣１８３８ｂｐ为３′－ＵＴＲ,在１８０１￣１８０６ｂｐ有一个加尾信号序列ＡＡＴＡＡＡ,３′端为１８     

不同因素对泡囊水溶液中磷脂酶A2活性的影响

首次在泡囊水溶液中研究磷脂酶A2 催化水解卵磷脂并考察了各种因素对该反应的影响.研究结果表明:在泡囊水溶液中磷脂酶A水解卵磷脂的最佳温度为 50℃.     

人胰岛素A链与B链基因的化学合成,克隆与表达

采用大肠杆菌密码子，用化学法分别合成人胰岛素２１个氨基酸的Ａ链，３０个氨基酸的Ｂ链，并在基因的５端引入甲硫氨酸密码子，尾部加入终止密码，两端加入限制性内切酶，Ａ链为８３个核苷酸，Ｂ链为１１０个核苷酸，经纯化后的寡聚核苷酸进行酶促连接反应后，分别克隆了人胰岛素Ａ、Ｂ链基因，然后选用ＰＬ启动子，构建了以牛生长前１３４个氨基酸的大片段基因，分别与人胰岛素Ａ链、Ｂ链基因的融合基因的融合基因的表达质粒ＰＬＷ     

模型胆汁中磷脂酶A2活性测定的新方法

胆石病是一种常见病和多发病.胆石病不仅会引起急性胆绞痛,还会引起心律失常、肝功能衰竭等并发症,严重的会导致糖尿病和胆囊癌.胆固醇、卵磷脂和胆汁酸盐是胆汁中的主要成分.胆固醇几乎不溶于水,在胆汁中主要由胆盐与卵磷脂形成的胶体溶解,在胆汁中胆固醇过饱和而析出是胆固醇结石形成最主要的原因.     

磷脂酶A2水解卵磷脂研究的新方法

磷脂酶A2(Phosphatide a-acyl-hydrolase, EC3.1.1.4)是一类催化磷脂二位酰基水解的脂肪酶,广泛存在于细菌、植物哺乳动物的组织、细胞和分泌物中,具有产生炎性介质、参与磷脂重建、促进血液凝固等作用.研究证明,在肺脏、心血管、胃肠道、皮肤、骨骼等系统的急、慢性炎症中,磷脂酶A2活性均有增高并介导一系列病理、生理过程[1].另外,磷脂酶A2水解卵磷脂形成的溶血性卵磷脂在化学、制药和食品工业方面有重要的用途.     

水稻Sh2基因的分子克隆

实验通过构建以兰姆达噬菌体为载体的水稻基因组文库，用玉米的Ｓｈ２ｃＤＮＡ克隆作为探针，分离出水稻的Ｓｈ２ＤＮＡ克隆。经用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ氏印迹杂交分析，初步证明两个克隆是真实的水稻Ｓｈ２基因的克隆，命名为Ｓｈ２－６４和Ｓｈ２－１０１。     

水稻中一个与花发育相关的MADS-box基因的表达检测

根据MADS－box基因的保守区结构,设计简并性引物,利用RT－PCR从水稻（Oryza sativa L.)中克隆到一个新的水稻MADS－box基因cDNA睛段,将它命名为FDRMADS5．该基因核苷酸序列851bp,编码160个氨基酸,有典型的植物MADS－box基因的结构,FDRMADS5的Southern分析,表明它为单拷贝基因,用Northern检测了FDRMADS5的表达情况,发现该基因除了在花中有表达外,在水稻的根尖和幼苗端中也有微量的表达,这一结果表明,水稻的MADS－box基因功能可能并不局限于控制花的发育。     

DNA序列分析中克隆片段在M13的缺失及质粒载体的应用

应用新的亚克隆载体BLUESCRIPT M13克服了外源DNA缺失问题.采用外切核酸酶Ⅲ快速亚克隆法,在不知道任何内切酶位点的情况下,也能获得一系列适应于DNA顺序分析的重叠衔接克隆.用超螺旋双股DNA直接序列分析程序,简化了DNA序列分析工作.     

RBM13 cDNA的克隆及其表达谱分析

从人胎脑cDNA文库中克隆到一条长3479bp的cDNA,它含一个长903bp的开放阅读框架,拟编码一个300个氨基酸的蛋白质,其分子质量为35397u,等电点为5．35,与酵母MAK16蛋白的同源性为41％,该编码蛋白有一个双侧核定位信号motif和一个RNA结合motif,将这一新cDNA序列推导的蛋白命名为RNA结合基序蛋白13（RBM13）,基因定名为RBM13,用RBM13基因的cDNA探针进行Northern杂交,检测到3．6kb和2．2kb二种长度的转录本。在心脏,骨骼肌,肾脏和肝脏中有较高表达。     

脑表达的X连锁基因的克隆、染色体定位和初步功能研究

通过筛选人18周胎脑cDNA文库,得到一条与Bexl和Bex2在高度同源性的基因,经HUGO／GDB人类基因命名委员会的同意命名为BEX1,Northern杂交发现该基因在脑和胰腺中高表达,在心脏,胎盘,肝脏和肾脏中有较低表达,而在脑和骨骼肌中没有表达,用斯坦福大学G3辐射杂交系将BEX1定位于Xq22上的Marker DXS990和DXS 1059之间,以BEX1作为杂交探针小对小鼠的原位杂交中发现BEX1的小鼠同源基因在小鼠的生精小管中有表达,而在间质组织中没有表达,在成年小鼠（出生10周）中BEX1同源基因在生精小管的外周细胞中表达,在中层细胞（包括次级精母细胞和精子细胞）和内层细胞（主要由精子组成）中没有表达,而在6周的处于青春期的小鼠中,BEX1的同源基因在整个生精小管中都有表达,但外层细胞的表达比中层和内层细胞的表达要高得多,而在3周的幼年小鼠中,BEX1的同源基因仅有微量表达,所以BEX1在小鼠中的同源基因在青春期表达上升,生精小管成熟后表达维持在一定的水平,这提示BEX1基因可能参与精子发生及生精小管发育的过程。     

A Tumor Suppressor Gene fhit Prokaryotic Expression and Identification

The recomblnant expression vector pGEMD-fhit wMch contains full encoding region of fhit gene was constructed. The recomMnant was introduced into the BL21 (DE3) strain of E. coli and induced by 1 mmol/L IPTG to express a 29× 103 polypeptide of fhit fusion protein. And the 29× 103 protein was sensitive and specific in reaction with anti-fhit antibody in Western blot.     

人RP2基因在果蝇胚胎细胞中的表达

将质粒pJLA503中的RP2编码cDNA用PCR的方法扩增,并与pIND-3myc质粒上的人c-myc编码序列连接到果蝇转基因载体pUAST上,构建了UAS－RP2－3myc和UAS－RP2(del6)-3myc融合质粒。用脂质体转染的方法,将质粒导入果蝇培养细胞系Schneider line2(S2),并用PCR加以证实,然后通过Western blot检测证明了RP2和RP2 del6的表达。证明了人的RP2基因在果蝇细胞中表达的可能性,说明果蝇系统是可以用来分析人的RP2基因功能的。     

Ubiquitin真核表达载体构建及在293T细胞中的表达

为构建泛素分子pcDNA3.1-Myc-ubiquitin真核表达载体,实现其在293T细胞中表达。采用人工合成ubiquitin基因序列并加入c-Myc标签序列及EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的方法,克隆至pcDNA3.1真核表达载体中。重组表达质粒经PCR和测序鉴定正确后,脂质体法转染入293T细胞。Western blot和间接免疫荧光法分析重组质粒在细胞中的蛋白表达及定位情况。菌落PCR及测序等分析结果显示:成功构建了pcDNA3.1-Myc-ubiquitin真核表达载体。免疫荧光和Western-Blot结果显示:Myc-ubiquitin重组表达质粒在293T细胞中获得高效表达且蛋白定位于胞浆。由此可知,成功构建pcDNA3.1-Myc-ubiquitin融合表达载体并在293T细胞中高效表达,为课题组进一步探讨与泛素化修饰相关的neuritin的作用机制及功能奠定基础。     

MSP58基因在肝癌中的表达分析

探讨MSP58基因在人类肝癌肿瘤组织及肝癌细胞系中的表达情况,应用半定量RT-PCR和Western blot方法分别检测MSP58在肝癌细胞系及肝癌肿瘤组织中的mRNA水平及蛋白水平的表达.两种肝癌细胞系HHCC、HepG2,22例肝癌癌区组织,13例正常肝组织作为对照.结果在两种肝癌细胞系中MSP58 mRNA水平和蛋白水平都有明显表达;在22例肝癌肿瘤组织中,不同级别的人肝癌肿瘤标本中mRNA及蛋白均有MSP58表达,并且MSP58的表达量随着人肝癌肿瘤恶性病理级别的增高而增高;13例正常肝组织无表达.MSP58在肝癌肿瘤组织和肝癌细胞系中均有表达,说明其可能对肝癌肿瘤的发生或发展有重要作用.     

Cloning, Expression of Crocus sativus Phytoene Desaturase Gene and Preparation of Antiserum against It

0　IntroductionCarotenoidsareisoprenoidmoleculesneededin plantsforgrowthanddevelopment.Theyparticipateinlightharvest inginphotosyntheticmembranesandprotectthephotosyntheticapparatusfromexcessivelightenergybyquenchingtripletchloro phylls,superoxideanionradicalsandsingletoxygen[1 ] .Further more,theyareessentialcomponentsofsome pigment proteincomplexes[2 ] andareprecursorsofabscisicacid (ABA)oftheplanthormone[3] .Carotenoidsaresynthesizedandaccumulatedinplastidsbynuclear encodedenzymesinplasti…