HBV cccDNA检测方法的研究进展

目前全球约有2.57亿慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染者,是当前最为突出的公共卫生问题之一. HBV感染的肝细胞内稳定存在的共价闭合环状DNA(cccDNA)是造成HBV感染持续、抗病毒治疗停药后病毒反弹的重要原因.现有Anti-HBV药物难以有效清除或直接抑制肝内cccDNA是慢性乙肝难以治愈的关键瓶颈.缺乏简单易行的cccDNA定量检测方法,影响了靶向cccDNA的Anti-HBV新药研发进展,也阻碍了这一指标在慢性乙肝患者临床管理实践中的应用. Southern blot被认为是目前cccDNA实验室检测的"金标准",但其操作复杂且灵敏度低,不适合于高通量药物筛选及临床应用.基于PCR的cccDNA检测方法相对操作简单、检测灵敏度更高,但其可靠性仍有待考验.本文系统整理分析了cccDNA样品提取和测定方法的研究现状与进展,希望通过综合比较不同cccDNA检测技术的性能和特点,为cccDNA相关基础研究、药物发展与临床研究提供方法学参考.     

HBeAg阴性小鼠模型的研究现状与展望

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球肝病的重要原因之一,全球约有2.5亿患者感染HBV.其中,慢性HBV感染将导致肝纤维化(liver fibrosis),肝硬化(liver cirrhosis, LC)甚至肝细胞癌(hepatocellular carcinonma,HCC). HBV感染的临床进程可分为乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)阳性和HBeAg阴性两个阶段.而长期携带和难以清除的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)是两个阶段共同的固有特征.慢性HBV感染不能完全治愈,其致命原因是没有有效药物能彻底清除cccDNA;严重瓶颈是无理想的实验动物模型,尤其是针对HBeAg阴性cccDNA小鼠模型.目前, HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者在全球范围内呈逐年上升趋势,本文就cccDNA的重要性、HBeAg基因结构及HBeAg转阴机理、HBeAg阴性cccDNA小鼠模型的研究现状与未来的应用前景进行简要述评.     

乙型肝炎抗病毒药物研究进展

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)在世界范围内流行,能够引起急、慢性肝炎,其中长期慢性感染可增加肝硬化及肝癌的发病风险.抗病毒药物治疗是控制HBV慢性感染的有效方法.目前应用于临床的抗HBV药物主要有两类:α干扰素和核苷(酸)类似物.这两种药物虽然可以抑制病毒复制,减轻或消除肝脏病理损害并有效阻止病情向肝硬化和肝癌发展,但并不能有效地达到HBV表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg)使其转阴并清除病毒共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA),所以HBV慢性感染很难治愈.近年来,随着人们对HBV研究的深入,针对其复杂的感染机制及病毒与宿主免疫系统之间相互作用的不同靶点药物被相继开发出来.本文对近年来在病毒直接靶向和宿主靶向药物(一些目前正处于临床试验阶段),以及免疫治疗药物研发方面所取得的进展进行综述.此外,还对高通量筛选技术(unbiased high-throughput screens)寻找新的抗病毒化合物,以及老药新用的策略用于抑制HBV进行了探讨.     

乙型肝炎病毒cccDNA体外实验模型研究进展

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一种小的DNA包膜病毒,属于嗜肝DNA病毒科.在细胞核内, HBV部分双链的DNA基因组修复为共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA),后者作为HBV复制的原始模板起始病毒转录. cccDNA具有显著的稳定性,是HBV持续感染的分子基础,也是抗病毒药物设计的关键靶点.HBV cccDNA研究常受限于细胞内较低的拷贝数,以及缺乏灵敏、可靠的检测方法,因此,建立合适的cccDNA实验模型具有重要意义.本文对近年来HBV cccDNA体外实验模型方面的主要研究进展进行综述,以期为深入研究HBV病毒学和抗病毒药物研发提供帮助.     

CRISPR专利环境的不确定性

<正>CRISPR-Cas9知识产权的专利战与这一技术本身一样,是一段颇具传奇色彩的微妙故事。2012年5月,加利福尼亚大学(UC)伯克利分校为生物化学家詹尼弗·杜德纳(Jennifer Doudna)和维也纳大学的埃马纽埃尔·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)开创性的细菌CRISPR-Cas9基因编辑系统申请了专利,他们在观察研究中发现,该系统可通过重新编程向导RNAs靶向到不同的DNA序列。之后,博德研究所(隶属于麻省     

HBV cccDNA的表观遗传学修饰及调控

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一个重大的世界性公共卫生问题. HBV能够引起急性或慢性病毒性肝炎,最终导致肝硬化甚至肝癌的发生.现行的临床抗HBV药物,如α干扰素和核苷(酸)类似物等,虽可有效抑制病毒复制,但不能彻底清除病毒.其根本原因在于, HBV感染肝细胞后形成共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, ccc DNA),并以微染色体的形式独立稳定存在于肝细胞核内.表观遗传学修饰可在不改变DNA序列的情况下,影响基因的表达.越来越多的证据表明, ccc DNA的表观遗传学修饰是调节HBV生活周期的重要因素.本文就HBV ccc DNA的表观遗传学修饰和调控作用、表观遗传修饰药物和治疗,以及表观遗传学研究方法和体系等进行综述.     

CRISPR-Cas9技术发展史:25年的科学历程

CRISPR-Cas是一种重要的原核生物获得性免疫系统。CRISPR序列可转录并加工为非编码RNA——cr RNA,而Cas利用其DNA核酸外切酶完成RNA介导的靶DNA剪切,从而抵御噬菌体和质粒等DNA的入侵。在这一系统基础上改进并发明目前生命科学领域广泛应用的CRISPR-Cas9基因编辑技术。通过对CRISPR序列发现、结构命名、功能预测、实验证实、机制研究和系统改进等的描述,以期能对CRISPR-Cas9技术的诞生过程有一个全面的了解。     

应用比较基因组分析检测乙型肝炎病毒中可能的重组事件

应用生物信息学软件RDP3和Simplot及5种重组检测算法(RDP,GENECONV,MaxChi,Chimaera和SiScan),对791个人类乙型肝炎病毒(HBV)全基因组和38个非人灵长类乙型肝炎病毒全基因组序列进行了比较分析,以检测可能的重组事件及重组子.用RDP3检测出9个重组事件及61个重组子,并用Simplot分析确定了具有两条亲代序列的6个事件中重组发生的位置.61个重组子中53个为首次发现.研究还表明PreC/C基因区域和基因边缘附近发生重组频率较高.     

全球首例基因编辑人体临床试验在中国进行

正由四川大学华西医院的肿瘤学家卢铀领导的团队,从8月份起,开始在肺癌患者身上测试CRISPR-Cas9细胞,并将成为首个把CRISPR-Cas9基因编辑技术修饰的细胞注入人体的国家。据悉,这项临床试验将招募化疗、放疗等常规治疗无效的转移性非小细胞肺癌患者,从患者血液中采集T细胞,然后使用CRISPR-Cas9技术来敲除细胞中的一个基因。经过基因编辑的细胞会在实验室进行培养增殖,     

宿主因子参与HBV cccDNA形成和转录

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是引起乙肝的病原体. HBV基因组是一个不完全双链环状DNA(relaxed circular DNA, RC-DNA).当HBV在宿主细胞中复制时,首先RC-DNA需要转化为共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, ccc DNA),后者作为HBV的转录模板,产生病毒的亚基因组和各种m RNA.其中,pg RNA作为逆转录模板逆转录负链DNA,继而合成正链DNA,最后组装成新的RC-DNA. ccc DNA的存在是干扰素(IFNs)、核苷类似物(NAs)等药物无法彻底消除乙肝抗原、治愈乙肝的重要原因. HBV ccc DNA的形成和转录过程受到许多宿主因子的调控,本文从乙肝病毒的感染和复制特征出发,总结了在各个过程中参与HBV ccc DNA形成和转录的宿主因子,对有关HBV ccc DNA形成的具体过程以及调控机制的研究具有一定指导意义.     

乙型肝炎病毒DNA的克隆及其在猴肾细胞中的初步表达

自从乙型肝炎病毒(HBV)基因克隆成功以后,人们开始用重组DNA技术来解决HBV或其表面抗原(HBsAg)在培养细胞中的表达问题,并已相继取得进展。我们克隆了     

CRISPR/Cas工具的开发和应用

CRISPR/Cas系统是细菌、古菌抵抗外源DNA或RNA入侵的免疫系统,细菌和古菌通过crRNA和Cas蛋白识别靶标DNA或RNA,并切割这些外源入侵核酸.目前, CRISPR/Cas系统已广泛应用于基因编辑领域,多种Cas蛋白的发现扩宽了CRISPR/Cas编辑基因的范围.如Cas9和Cas12可在基因组上靶向插入或删除DNA序列; Cas13和RCas9可靶向切割RNA.另外,多种Cas衍生工具的开发让CRISPR/Cas系统发挥更多的功能.如基因编辑方面,通过base editor可进行DNA单碱基编辑,通过prime editor可进行DNA单碱基编辑和小片段插入缺失;如基因表达调控方面,通过CRISPRa和CRISPRi可以激活或抑制基因RNA表达.同时, CRISPR/Cas系统还广泛应用于功能基因遗传筛选、基因检测、活体成像、细胞谱系示踪等多个领域.随着CRISPR/Cas基因编辑工具的不断开发,将不断促进科学研究进展,并有望通过CRISPR/Cas介导的基因治疗为患者带来福音.     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗β-地中海贫血的最新进展

地中海贫血是β-珠蛋白基因(HBB)点突变或缺失引起的单基因遗传病,患者产生溶血性贫血,其生存主要依赖于反复输血及去铁治疗,最终导致多器官受损、衰竭,给个人、家庭和国家带来严重的经济负担.随着基因编辑技术的蓬勃发展,可能治愈基因突变性疾病的基因治疗应运而生,其中CRISPR/Cas9基因编辑技术凭其靶向特异性、经济性等优势备受关注,并已广泛应用于分子生物学以及生命科学领域的研究.如今CRISPR/Cas9基因编辑技术修复人多能干细胞HBB基因、诱导胎儿血红蛋白(HbF)合成或抑制α-珠蛋白基因(HBA基因)表达是治愈β-地中海贫血的三大可行性策略,相关临床试验已相继开展.本文就CRISPR/Cas9系统的研究进展、作用机制以及在治疗β-地中海贫血的最新研究与应用进行综述,涉及细胞实验、动物模型、临床试验等内容,并介绍了CRISPR/Cas9系统衍生的新型基因编辑工具碱基编辑器在该领域的研究应用,为促进β-地中海贫血从基础研究转向临床治疗提供新的思路和方向.     

新型HLA-A2限制的B, C型HBV特异性CTL表位的筛选及鉴定

乙型肝炎病毒(HBV)特异性CD8+ T细胞(CTL)介导的细胞免疫应答在控制HBV感染和病毒清除中至关重要, 已鉴定的T细胞表位绝大多数都来自A, D基因型的乙肝病毒, 而在我国流行的B, C型病毒表位研究较少. 本研究合成重叠九肽肽库, 通过细胞结合试验和体外重折叠实验系统筛选和鉴定B型和C型HBV核心蛋白表位, 发现一个在60位氨基酸由L变异成V(L60V)而产生的新表位HBcAg60-68. 表位肽能在HLA-A2/K^b转基因小鼠体内激发特异性CTL细胞免疫反应. 检测HLA-A2阳性乙肝患者表位特异性CTL证明该九肽序列为体内自然加工的表位, 这为研究HBV感染中特异性CTL免疫应答提供新的依据.     

HBx对HBV复制的调控

乙型肝炎病毒(HBV)是导致肝细胞肝癌(HCC)发生发展的重要诱因之一. HBV在感染细胞后进行病毒DNA的复制、病毒蛋白的合成以及新病毒颗粒的包装和释放等步骤,其中病毒感染细胞逃避宿主免疫后,就可能通过HBV复制产生子代病毒、形成持续感染、诱导肝癌的发生发展.机体中HBV的复制受到多种因素的影响,而乙型肝炎病毒的X蛋白(HBx)对于HBV复制的影响是其中一个重要因素.本文在对HBx蛋白的结构组成及其分布做简要阐述的基础上,重点综述HBx通过不同的修饰途径来调控HBV的复制,以及HBx通过mi RNA来调节HBV复制的进程.     

基因编辑技术:一场正在进行的革命——伊曼纽尔·查朋特访谈录

<正>2012年,伊曼纽尔·查朋特(Emmanuelle Charpentier)在研究中与他人共同发现了CRISPRCas9系统:一个正在改变着基因组学、遗传学和基因工程领域的工具。CRISPR-Cas系统是由RNA和蛋白质构成,可以识别入侵病毒DNA并可将其分解(CRISPR表示成簇规则性排列的短回文间隔重复序列,用于描述基因的排列方式)。对于许多细菌和古细菌而言,该系统就相当于一个有效的免疫系统,可以广     

成功破译乙肝病毒新基因

解放军第302医院传染病研究所副所长、基因治疗研究中心主任、病毒性肝炎治疗研究首席专家成军博士领导的课题组经过5年的潜心研究,在乙型肝炎病毒(HBV)基因组中发现了2个新的基因,这在HBV基因发现的25年来是第一次,研究结果改写了乙型肝炎病毒研究的历史,引起了国内外同行的高度关注和赞誉。自然科学研究的主要目的就是揭示自然规律。1979年国外学者首次克隆了HBV的基因组之后,对于HBV感染引起的急性、慢性病毒性肝炎、肝纤维化/肝硬化、肝细胞癌(HCC)的研究和临床起到了十分重要的推动作用。根据这一研究结果,基本上解决了乙型病毒…     

多重靶向纳米递送系统为CRISPR/Cas9体内编辑提供输运工具

<正>CRISPR/Cas9系统是近年来发展起来的一组强大的基因编辑工具.CRISPR/Cas9系统可以对哺乳动物细胞进行基因编辑~([1]).CRISPR/Cas9由两部分构成,一部分是可以对DNA序列进行酶切的Cas9内切核酸酶,它可以引起靶标DNA的双链断裂;另一部分为引导RNA(guide RNA,gRNA),它可以特异性识别并结合DNA靶序列.在gRNA     

自噬在乙肝病毒引起的疾病中的功能

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)属于嗜肝DNA病毒科家族成员之一,全世界约有20亿人受到HBV感染,其中约3.5亿人是HBV携带者, HBV携带者中HBV长期低水平复制导致肝炎、肝硬化和肝细胞癌的发生.在这一过程中,越来越多的证据表明自噬扮演了重要角色.本文将从HBV在自噬不同阶段的作用,以及HBV引起的肝损伤和肝癌过程中自噬的功能这几个方面进行综述,以期为深入探索HBV病毒致病机制和筛选抗病毒的靶点、研发抗病毒药物提供有效的帮助.     

基因剪刀剪掉HIV病毒

<正>科学家开发了一种最新联合疗法,将持续递送抗逆转录病毒的给药系统与CRISPR-Cas9基因编辑技术相配合。这种疗法首次从活体动物的基因组中消除了HIV-1的DNA,标志着在开发新疗法,治愈人类HIV病毒感染的征途上迈出了关键一步。与早期的基因疗法不同,CRISPR可精确定位特定基因。在最新一项用CRISPR和一种高效的普通ART药物同时打击病毒