基因的瞄准器：基因靶向技术 ——评2007年诺贝尔生理学或医学奖

2007年10月8日，美国科学家马里奥•卡佩奇和奥利弗•史密斯、英国科学家马丁•埃文斯因为“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物DNA重组方面的一系列突破性发现”(即“基因靶向”技术)而获此殊荣，该技术在研究基因的功能以及建立人类疾病模型等方面开创了一个全新思维模式和技术手段。本文将就“基因靶向”技术作一简要介绍。     

在小鼠进行基因打靶的研究进展

基因打靶是在生物活体研究基因功能的有效手段,通过基因打靶可以对小鼠染色体组进行特异性的遗传修饰,包括简单的基因剔除、点突变的引入、染色体组大片段的删除和重排以及外源基因的定位整合等。近年来的研究表明,对基因打靶进行时间和空间上的调控已成为可能。     

基于BAC同源重组高效构建小鼠胚胎干细胞Nanog基因报告体系

Nanog是最新发现的一个在胚胎干细胞(ES细胞)中特异表达, 并在保持ES细胞多能性的机制中有重要作用的转录因子. Nanog基因的表达能非常灵敏地随ES细胞的分化而下调, 使之成为指示ES细胞多能性最理想的标志基因之一. 本研究基于细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)同源重组技术, 并改进了将报告基因敲入目的位点的重组方案, 高效构建了小鼠ES细胞(mES细胞)的Nanog/EGFP报告体系. 基因打靶后的mES细胞具有与其源mES细胞相同的特性, 并能稳定地将Nanog与EGFP (enhanced green fluorescence protein)的表达偶联. 此报告体系能通过EGFP的表达有效报告Nanog基因的表达水平, 从而对mES细胞分化或未分化状态作出明显指示. 本研究为mES细胞自我更新和分化的研究提供了一个理想的实验体系, 不仅能用于进一步优化mES细胞的培养体系, 对研究Nanog的表达调控及其与其他维持mES细胞多能性的因子和途径之间的关系也有深远的意义.     

维持Oct-4基因表达对小鼠胚胎干细胞分化的影响

通过导入外源性表达的Oct-4基因,使小鼠胚胎干细胞（ES细胞）在维甲酸诱导分化后仍继续维持Oct-4基因的表达,建立了Oct-4基因维持表达的ES－O细胞株。研究发现,在缺乏干细胞分化抑制因子LIF的情况下,Oct-4基因的维持表达本身并不能维持ES－O细胞的干细胞特性;在LIF存在时,Oct-4基因的维持表达增强了ES－O细胞维持干细胞未分化状态的能力, 而且部分抑制了维甲酸诱导的细胞分化,说明Oct-4基因与LIF协同作用才能维持ES细胞的未分化状态,在细胞分化过程中,ES－O细胞倾向于向神经细胞分化,提示Oct-4基因的维持表达可能与神经外胚层分化相关。     

基因抑制蛋白质揭示干细胞奥秘

科学家已经采取措施来揭示“干细胞性质”的奥秘:将对是什么促使胚胎干细胞(ES)能无休止地复制并保持其演变成为任何种类人体细胞的潜能作出解释。近期《细胞》和《自然》杂志上发表的论文称,保持干细胞特性的关键因素是称为多冠状聚合蛋白质的分子。美国麻省理工学院(MIT)和剑桥怀特黑德生物医学研究所的研究小组报道,这些蛋白质和其他蛋白质协同作用以抑制大部分调节基因(调节基因的蛋白质启动起关键作用的发育基因),使胚胎干细胞保持处于未分化状态。已知多冠状聚合蛋白质在诸如果蝇和人等不同生物体的发育上,都具有关键性的抑制基因的…     

两性小鼠核移植胚胎干细胞系的建立及其在胚胎干细胞多能性评估中的研究

治疗性克隆的安全性与风险性是阻碍治疗性克隆发展的关键环节之一. 由于受到社会伦理问题的限制, 人胚胎干细胞的多能性检测只能通过畸胎瘤的方式鉴定, 与传统的小鼠生殖系嵌合鉴定方式不同. 但是两种多能性检测方式之间的区别还不清楚. 本研究利用遗传突变两性小鼠心肌成纤维细胞作为核移植供体细胞, 构建核移植胚胎, 经过体外培养获得克隆囊胚, 建立核移植胚胎干细胞系. 对胚胎干细胞系的鉴定结果表明, 两性小鼠核移植胚胎干细胞系表达所有小鼠胚胎干细胞系多能性及特异的分子标记, 如碱性磷酸酶活性, Oct4, Nanog, SSEA-1等, 干细胞注射到免疫缺陷小鼠(SCID)体内能够形成含有三胚层分化附属物的畸胎瘤组织, 证明两性小鼠核移植胚胎干细胞系具有多能性. 但通过囊胚注射的方式获得的二倍体嵌合小鼠经过交配不能获得生殖系嵌合的小鼠, 因而两性小鼠核移植胚胎干细胞系并不具有全能性, 说明体内形成三胚层分化附属物的畸胎瘤组织并不能替代传统的生殖系嵌合, 提示在人治疗性克隆胚胎干细胞系多能性鉴定中, 仍然需要更多、更严格的标准, 进而最大程度地降低治疗性克隆临床应用的风险性.     

“基因敲除”研究进展

本文概述了基因敲除技术的原理及研究进展,尤其对条件性基因敲除进行了系统性的详细介绍,并简述了其在动物发育和基因表达机制研究中的重要意义.     

诺贝尔医学奖射中"基因靶向"

瑞典卡罗林斯卡医学院10月8日宣布,将2007年诺贝尔生理学或医学奖分别授予美国人马里奥·卡佩奇(Mario R.Capecchi)、奥利弗·史密斯(Oliver Smithies)和英国人马丁·埃文斯(MartinJ.Evans)。他们将赢得1000万瑞典克朗(约合154万美元)的奖金。获奖原因是为基因靶向技术的发展奠定了基础。这项技术利用胚胎干细胞,改造老鼠体内的特定基因。     

荧光磁性纳米粒子标记的小鼠胚胎干细胞靶向识别体内胃癌细胞

胃癌的早期诊断和治疗是提高胃癌患者预后的关键, 纳米技术和干细胞是继手术、化疗和放疗之外新兴的肿瘤治疗新技术. 制备了氨基化修饰的荧光磁性纳米粒子(FMNPs), 无滋养层培养了小鼠胚胎干细胞(mESCs), 体外实验评价了mESCs的条件培养基对胃癌细胞的影响, 并利用FMNPs标记mESCs制备了干细胞纳米探针(FMNPs-mESCs), 通过尾静脉注射进入荷瘤小鼠的体内, 利用小动物活体成像系统考察了FMNPs-mESCs靶向识别体内胃癌细胞的能力. 结果显示, 制备的FMNPs具有良好的荧光性能和磁响应性能, 在50 μg/mL的浓度范围内对mESCs具有良好的生物活性, mESCs的条件培养基对胃癌细胞具有显著的抑制增殖的作用, FMNPs标记的mESCs具有良好的荧光性能, 在注射进入荷瘤小鼠体内6 h后可以通过活体成像结果和离体器官的荧光成像结果观察到肿瘤组织有显著的荧光信号. 研究表明, FMNPs-mESCs具有特异靶向识别体内胃癌细胞的能力, 为利用胚胎干细胞治疗胃癌提出新的研究方向.     

游离的小鼠胚胎卵巢细胞体外重组形成卵泡

胚胎期生殖细胞和体细胞相互作用形成卵泡是一个复杂的生理过程,生殖细胞定向分化成卵母细胞后,必须以卵泡的形式存在才有可能完成最终的生长发育。因此,研究生殖细胞和体外细胞体外重组形成卵泡的可能性具有重要的理论和实践意义。利用微滴培养法将胶原酶消化分离的12－16d胎龄的小鼠卵巢细胞分别培养,发现不同胎龄的卵巢细胞均能相互黏连形成多细胞聚集体：12－13d胎龄小鼠卵巢细胞体外不能形成卵泡：14－15d胎龄小鼠卵巢细胞体外经过4d培养后形成少量卵泡样复合体。16d胎龄小鼠卵巢细胞培养2d后形成大量具有典型卵泡特征的小卵泡。实验结果直接证实一定胎龄的小鼠卵巢生殖细胞和体细胞能够在体外重新构建形成卵泡;胎鼠卵巢生殖细胞获得诱导体细胞分化形成卵泡的能力是一个渐进过程。该研究为卵泡体外重组并重新构建卵巢进行卵巢移植提供了直接的实验依据。     

关闭干细胞的基因

生物学家日前发现寿命与癌变之间可能存在某种密切的联系,即有一种基因能随着机体的衰老而将其干细胞关闭。这种重要的基因在抑制肿瘤方面所起的作用已很显然。现在看来,它似乎还是促使生物体生与死的一种重要介质。生命的持续需要细胞的不断更新,这也是机体让细胞分裂的必然结     

基因景象

当细胞的DNA连通的时候,新型核磁共振成像技术就使细胞清晰可见     

整合素 aVβ3在小鼠胚胎植入中的作用

整合素是一类由a , b 亚基构成的异二聚体黏附分子, 能够调节细胞间的黏附和细胞通讯. 近期研究表明, 整合素αVβ3在胚胎"植入窗口"期能够参与母胎相互作用, 是子宫内膜接受性的标记分子, 同时决定胚胎侵入性. 就此作用机理作了进一步研究. 间接免疫荧光和激光共聚焦扫描 (confocal) 结果显示, 整合素αVβ3在小鼠胚泡中明显表达. 妊娠第3天小鼠子宫角注射αVβ3抗血清显著降低妊娠第8天子宫角的着床胚胎数 (P < 0.001). 在共培养体系中, 1∶100 和1∶200稀释度的整合素αVβ3抗血清对小鼠胚泡在子宫上皮细胞单层上的黏附和扩展有显著抑制作用. 相关分析显示, 整合素αVβ3抗血清的这种抑制作用具浓度/稀释度依赖性. 由此可见, 整合素αVβ3是小鼠胚胎植入子宫内膜中的必需因子, 它在"植入窗口"期的小鼠胚泡中明显表达, 能够通过作用于胚泡滋养层在子宫上皮细胞的黏附和扩展途径来调节胚胎植入过程.     

一种新的小鼠被毛突变基因定位

分别尝试用ＲＡＰＤ（随机扩增多态ＤＮＡ）法和重组率测定法对所发现的被毛突变进行基因定位。结果为所选用的１００个１０ｂｐＲＡＰＤ引物中,８７个获得了扩增产物,由于所获得的产物与小鼠表现间缺乏相关性,利用ＲＡＰＤ法未能交闰到染色体上。以分布于小鼠１１条染色休下的Ｉｄｈ１,Ｃａｒ２,Ｍｕｐ１,Ｐｇｍ１,Ｈｂｂ,Ｅｓ１０,Ｅｓ１,Ｍｏｄ１,Ｇｄｃ１,Ｃｅ２,Ｅｓ３等生化基因位点为遗传标记,对分别对与ＣＡＢ     

真核基因转录的分子机制——2006诺贝尔化学奖简介

2006年10月2日,瑞典皇家科学院宣布,将本年度诺贝尔化学奖授予美国科学家罗杰·科恩伯格(RogerD.Kornberg),以表彰他在真核基因转录的分子基础研究领域所做出的杰出贡献。真核基因转录的分子机制是什么?这一机制是怎样被发现的?本文拟从这两个方面对这一领域做一点粗浅的介绍。     

LeY对小鼠胚泡和子宫上皮细胞分泌MMPs的影响

以单克隆抗体ＡＨ６［特异结合Ｌｅ＾Ｙ寡糖,Ｆｕｃ α１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃ－］为工具,采用明胶酶谱法,研究细胞表面的Ｌｅ＾Ｙ寡糖抗原与羊床期间小鼠胚泡和单层子宫上皮细胞分泌基质金属蛋白酶（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ,ＭＭＰｓ）之间的关系,从而进一步确定Ｌｅ＾Ｙ寡糖抗原在着床过程中的具体作用环节。结果显示,不论子宫上皮细胞表面还是胚胎滋养层细胞表面的     

2-细胞小鼠胚胎电融合后的体外发育

细胞融合是研究细胞调节机理和多倍体对发育作用的技术。研究多倍体胚胎常用的手段是采用灭活的仙苔病毒(ISV)融合法、聚乙二醇(PEG)诱导融合法、细胞松弛素B(CB)介导法和电融合(EF)法。国外学者采用这4种方法均获得小鼠、大鼠和兔融合胚胎,分别研究了融合胚胎在体内或体外的发育。目前国内对小鼠多倍体胚胎研究的报道很少。黄少华等报道的小鼠电融合胚胎在体外培养时分裂率很低,未能从核型证明融合胚胎为四倍体,因为只有个别分裂胚胎在体外发育到8-细胞阶段。本实验采用电融合法研究2-细胞小鼠胚胎融合后的体外分裂及发育,并利用细胞遗传学方法分析融合后胚胎体外发育而成的附植前胚胎的染色体分裂相和分裂球数目,证明胚胎的多倍性及分裂率;通过与正常1-细胞和2-细胞小鼠胚胎体外发育结果进行比较,揭示电融合胚胎在体外分裂与发育的规律,为进一步研究多倍体胚胎发育机制提供参考。     

胚胎发育合子型基因激活（ZGA）的调控机制

新受精卵超越早期分裂阶段正常的发育需要胚胎基因转录的重新起动与续后调控,ZGA（合子型基因激活）是胚胎发育过程中母型调控的合子型调控过渡中的关键事件,卵为新形成合子发育程序的起动提供了特殊的环境条件,并对其调节控制起了必要的作用,各类动物早期卵裂过程的胚胎基因转录起动精确时间是可变的,涉及染色质结构成分、调控元件（顺/反式）、RNA降解、DNA复制、修饰/加工作用、卵子发生因子、合子钟及天然信号等多种因素的调节控制,本文综述了当前胚胎发育合子基因表达的时间及相关调控机制的研究进展。