拟南芥NOA1蛋白的原核表达和分析

通过构建AtNOA1的GST融合表达载体,在E.coli中表达AtNOA1蛋白,并分析不同诱导条件对AtNOA1蛋白表达的影响.结果表明,22℃是AtNOA1表达的最适诱导温度,而IPTG浓度在一定条件下变化对AtNOA1表达量无明显影响.     

水稻磷酸酯酶2A基因蛋白的原核表达载体构建、表达和纯化

利用PCR技术,从水稻品种日本晴幼穗cDNA中扩增磷酸酯酶2A的基因ORF片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中构建重组质粒pGEX-6p-1-PP-2A,经限制性内切酶酶切鉴定以及测序结果表明成功构建了原核表达载体pGEX-6p-1-PP2A。转化E.coli JM109并通过终浓度为0．4mmol／L的IPTG诱导,表达出39kD的CST-PP2A融合蛋白,并用蛋白亲和层析柱GSTrap FF对表达产物进行纯化,为下一步的研究打下了实验基础。     

拟南芥Rad23原核重组蛋白构建和活性检测

在拟南芥中,Rad23基因通过参与泛素/26s蛋白酶体途径调节植物生长发育和激素应答.为进一步研究该基因编码蛋白的分子作用机制及其生物学功能,构建了pCold-Rad23融合蛋白重组表达载体,将该载体转化到大肠杆菌BL21中诱导表达目的蛋白.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果表明,分子质量为94 ku左右的融合重组蛋白在...     

拟南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表达及多克隆抗体的制备

转录因子AtERF1属于ERF/AP2家族的B3亚家族,参与植物的防卫反应.根据密码子简并原理,用基因全合成的方法合成了满足大肠杆菌密码子嗜好的编码拟南芥AtERF1蛋白的碱基序列,并将其克隆到原核表达载体pET-29b.将表达载体AtERF1-pET-29b转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG成功诱导表达了分子量约30kD的AtERF1蛋白,该蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在.以该蛋白为抗原免疫家兔,制备出的多克隆抗体经免疫双扩散测定效价达1∶16,Western blot检测表明该抗血清与AtERF1蛋白识别良好.AtERF1抗体的制备为进一步从生化水平上研究AtERF1的功能奠定了良好基础.     

HARDY转录因子原核表达的研究

HARDY（HRD）是AP2／ERF—like家族转录因子,它的过量表达可以增强水稻的抗旱性、提高水稻的水分利用率。本研究从拟南芥中克隆了HRD转录因子基因,利用DNA重组技术,构建了HRD原核表达载体PET．HRD,并将PET－HRD重组质粒转化E．coli BL21（DE3）,经1mmol／LIPTG诱导其蛋白质表达,获得了高表达量的分子量约为42kD的HRD融合蛋白。本研究结果为进一步制备HRD转录因子的抗体,并利用该抗体来分析和克隆不同物种的HRD基因奠定了基础。     

类硫氧还蛋白hTRXL I cDNA的克隆和原核表达

从人18周胎脑中提抽mRNA，建立cDNA文库，通过大规模测序克隆出一条人类基因，该基因全长1644bp，开放阅读框1146bp，编码一个含372个氨基酸的蛋白，预测分子质量约为46．8ku，经与蛋白数据库比较，发现具有人硫氧还原蛋白结构，命名为人的类硫氧还蛋白基因I（human THioredoxin like gene I,hTRXL I)，多组织膜Northern blot结果显示在心脏，脑，胎盘，肝，骨骼肌，肾，胰腺等各个组织中均有表达，肺中表达不明显，通过Unigene染色体定位，将hTRXL I定位于11q11,把hTRXL I的读框克隆人经改造的PBV220质粒中，在E，coli中诱导后获得表达。     

HPV23 L1蛋白的表达、纯化及活性鉴定

为了制备人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)23亚型的L1蛋白,结合大肠杆菌密码子偏好性,经密码子优化合成HPV23的L1蛋白编码区序列,并将其分别克隆至原核表达载体,成功构建了4种原核表达载体pET28a-23L1、pET30a-23L1、pET32a-23L1和pESUMO-23L1,随...     

斑马鱼GAPDH蛋白片段的原核表达差异分析

为了分析斑马鱼GAPDH基因不同区域原核表达构建的诱导效应差异,应用生物信息技术分析斑马鱼GAPDH分子结构,通过定向删除技术,构建表达部分斑马鱼GAPDH蛋白片段的质粒。通过IPTG诱导,SDS-PAG检测,分析GAPDH基因不同区域构建的蛋白表达差异。结果:引物对ZGCKF/ZGCXR构建的GAPDH重组表达质粒具有IPTG诱导表达效应,而引物对ZGNKF/ZGNXR构建的质粒则不具有IPTG诱导表达效应。因此,为了在原核表达真核蛋白时应考虑过表达的真核蛋白是否会影响宿主的代谢以及是否会导致宿主的抵抗,设计引物时应当选择合适的区域构建重组质粒才能获表达产物。     

TAT-GFP-ERβ融合蛋白的原核表达与鉴定

从前列腺中提取总RNA,RT-PCR获得ERβ基因,将其联人pEGFP载体,得到重组质粒pEGFP-ERβ,再将上述质粒的GFP-ERβ片段亚克隆于pTAT-2.1质粒,形成pTAT-GFP-ERβ重组质粒.在BL21工程菌中IPTG诱导表达TAT-GFP-ERβ融合蛋白.用Western Blot鉴定纯化的融合蛋白的免疫原性.用纯化的蛋白转导事先转染ERE-Luc报道质粒的Hela细胞,用Luciferase Assay鉴定转导蛋白的生物学活性.证明TAT-GFP-ERβ蛋白具有完整的生物活性.     

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843 bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%.将CP基因定向插入EcoR I/SalI切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为37 kD的CP蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4 h后蛋白开始表达,8 h后表达量比较大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与CP发生血清学反应.     

人泡沫病毒GAG、ENV蛋白的原核表达、抗血清制备及鉴定

构建了HFV的GAG和ENV蛋白原核表达载体pET-32a-gag和pET-32a-env,转化E.coli BL21Star(DE3)后用IPTG诱导出高水平的GAG、ENV融合蛋白表达.以融合蛋白免疫新西兰兔制备了GAG和ENV抗血清.Western Blot检测表明,抗血清可以识别原核表达的GAG和ENV蛋白,说明抗血清具有较好的特异性.结合Western Blot和间接免疫荧光实验,表明抗血清可以检测到病毒表达的GAG和ENV蛋白.     

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.     

重组人血管内皮生长因子165在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化与体外活性评价

人血管内皮生长因子165(VEGF165)可有效促进血管新生和增加血管通透性,在伤口愈合方面有重要医疗价值。建立获取高纯度、高活性的优质重组VEGF165蛋白的方法具有重要意义。研究利用带有6组氨酸标签的二硫键形成蛋白A(Dsb A)的E.coli表达系统实现了Dsb A-VEGF165融合蛋白的可溶性表达;诱导过程中添加5%(v/v)的乙醇可显著提高工程菌中可溶性融合蛋白表达水平。融合蛋白通过Ni亲和层析粗纯,并经牛肠激酶酶切去除标签蛋白。随后利用肝素亲和层析精纯获得重组人VEGF165蛋白。非还原及还原SDS-PAGE电泳检测到分子量为约40 k Da的同源二聚体蛋白,促HUVEC细胞增殖实验显示重组蛋白具有较优的活性,EC50为13 ng/m L。研究实现了Dsb A-VEGF165的在E.coli中可溶性表达,建立了经济、高效的纯化方法,获得了高质量、高活性的重组人VEGF165蛋白。     

pEGX-4T-2/NAP1融合蛋白的原核表达及鉴定

以鼻咽组织cDNA为模板,PCR扩增NAP1基因编码区,PCR产物克隆入pUCm-T载体,筛选阳性克隆. 构建NAP1基因编码区的原核表达载体pEGX-4T-2/ NAP1,转化大肠杆菌BL21. 经IPTG诱导表达后,在不同时段收集菌体,提取细菌的全部蛋白. 经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,发现细菌全蛋白中在35 KD～36 KD处多出一条明显条带. 用兔抗人NAP1多克隆抗体,利用Western Blotting对该融合蛋白的表达进行了鉴定,NAP1基因的融合蛋白表达成功,为制备NAP1单克隆抗体和获得有生物活性的NAP1蛋白,进一步研究NAP1蛋白的功能奠定了基础.     

带有TAT-PTD跨膜转导域融合基因的原核表达及表达条件优化

为构建pGEX-TAT-GFP原核表达质粒并优化GST-TAT-GFP表达条件,将PCR扩增的基因TAT-GFP克隆至质粒pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并优化表达条件,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及荧光学特性鉴定.结果表明:构建的质粒经PCR、酶切和DNA测序正确,含有重组质粒的宿主菌经过IPTG诱导表达分子量约为54.3 kD的融合蛋白GST-TAT-GFP,并经优化确定最佳的诱导表达条件.     

SpiC/SsaM蛋白质复合物的原核表达及纯化

沙门氏菌毒力岛2中spiC所编码的效应蛋白在沙门氏菌得以于宿主吞噬性细胞内的存活中起到重要作用．SpiC与位于相同操纵元的SsaM特异结合,暗示了SpiC／SsaM蛋白质复合物参与转运元的形成并调控其他效应蛋白的分泌．为了从蛋白质结构角度研究SpiC／SsaM复合物的生物学功能,原核体系中共表达了SpiC和SsaM．与SpiC形成稳定的复合物,改善了SsaM单独表达不可溶的情况．胰蛋白酶限制性酶切实验显示：相对单独存在于溶液中的SpiC,形成复合物的SpiC更加稳定．得到大量高纯度的胰蛋白酶处理后的SpiC／SsaM复合物,并进行了结晶试验,为后续结构学研究奠定了基础．     

甘蓝型油菜植物防御素基因的克隆与原核表达

根据Genbank上已知的植物防御素基因设计引物,以甘蓝型油菜中的品种”蜀杂九号”种子总RNA反转录成的eDNA为模板,进行PCR扩增,获得了243bp的片段．将该片段回收。连接到pMD18-T载体测序,将测序片段经酶切回收后克隆到GTK表达载体中,在0．1mmol IPTG诱导下表达出与理论值相符的34kD的融合蛋白条带,用GST单克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,获得阳性结果,这为甘蓝型油菜植物防御素基因功能的进一步研究提供了基础．     

淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白1.3 kb基因片段的原核表达

取淋巴囊肿病病毒感染牙鲆组织,蛋白酶K裂解,PCR法成功获得了淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白1.3 kb基因片段.构建其原核表达载体,IPTG诱导表达.结果表明,该融合蛋白分子量约70 kD,可与抗LCDV多克隆血清特异反应.为LCDV基因工程疫苗的研制奠定了实验基础.     

Cloning and expression of <Emphasis Type="Italic">AtPLC6</Emphasis>, a gene encoding a phosphatidylinositol-specific phospholipase C in <Emphasis Type="Italic">Arabidopsis thaliana</Emphasis>

A full-length cDNA clone corresponding to a putative phosphatidylinositol-specific phospholipase C(PIPLC) was isolated from Arabidopsis thaliana by screening a cDNA library and using RT-PCR strategy.The cDNA,designated AtPLC6,encodes a putative polypeptide of 578 amino acid residues with a calculated molecular mass of 66251.84 D and a pI of 7.24. The sequence analysis indicates that the polypeptide contains X, Y, EF-hand and C2 domains.The overall structure of putative AtPLC6 protein, like other plant PI-PLCs,is most similar to that of mammalian PLCδ The recombinant AtPLC6 protein expressed in E. coil was able to hydrolyze phosphatidylinositol 4,5-biophosphate (PIP2) to generate inositol 1,4,5-trisphate (IP3) and 1,2-diacylglycerol (DAG).The protein hydrolyzes PIP2 in a Ca^2 -dependent manner and the optimum concentration of Ca^2 is 10μmol/L.These results suggested that AtPLC6 gene encodes a genuine PIPLC.Northern blot analysis showed that the AtPLC6 gene is expressed at low level in all examined tissues, such as roots,stems,leaves,flowers,siliques and seedlings under normal growth conditions.The gene is strongly induced under low temperature and weakly induced under various stresses,such as ABA, high-salt stress and heat. These results suggested that AtPLC6 might be involved in the signal-transduction pathways of cold responses of the plants.