蛇足石杉内生真菌Shiraia sp.Slf14中Ⅲ型聚酮合酶的表达、纯化及生物信息学分析

竹红菌素是我国特有的一类苝醌类光敏色素,在开发新型抗肿瘤抗病毒药物、光敏活性农药及新型光电转换材料等方面应用前景广阔.聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)是合成竹红菌素的一种关键酶,通过全基因组测序及分析发现在Shiraia sp.Slf14中存在一个III型聚酮合酶基因.利用RT-PCR技术,以其总RNA为模板,扩增得到目的片段,并成功构建表达载体p ET-22b(+)-PKSIII,采用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了目的蛋白,SDS-PAGE结果显示表达重组产物分子质量约为43 k Da,与理论值一致,为III型聚酮合酶的催化活性研究提供理论依据.     

竹红菌素研究的进展

竹红菌素(Hypocrellin)是在我国最早发现的一种新型光敏剂.它的光生物活性可抑制细菌生长.近几年的研究表明,细胞吸收后,它主要分布于细胞膜及胞浆中,只有少量的进入细胞核中.竹红菌素加光照后对细胞具有明显的杀伤作用,使细胞存活率显著下降.竹红菌素光敏作用靶部位是细胞膜,线粒体和微粒体是其敏感靶部位,而光敏作用引发的脂自由基等产物可能是诱导DNA等损伤,最终导致细胞死亡的重要原因.     

产生苝醌类化合物真菌的化学成分及光敏活性研究

 研究菌寄生菌属真菌(Ascomycetes Hypocreaceae Hypomyces(Fr.)Tul.sp.)菌丝体的化学成分.用丙酮回流提取,用二氯甲烷和甲醇洗脱,硅胶H柱层析分离,化学与波谱学进行结构鉴定.从菌丝体中分离得4个化合物,分别鉴定为甘露醇(I),痂囊腔菌素A(II),竹红菌甲素(III)和竹红菌乙素(IV).用微生物纸片法测定了化合物II,III,IV的光敏活性.     

荧光假单胞菌phlD基因的克隆、表达及功能

对荧光假单胞菌合成2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)操纵子的关键基因phlD进行了克隆,并采用E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)对phlD进行了诱导表达,其指导合成的PhlD蛋白融合表达后为42000Da.生物信息学方法分析PhlD具有PKSⅢ型聚酮合酶的结构及催化聚酮缩合、酰基转移反应的功能,并推测PhlD催化底物丙二酸单酰辅酶A经过聚酮缩合途径合成间苯三酚及其衍生物.对重组菌进行了摇瓶发酵并检测出发酵液中确有产物间苯三酚的合成.     

二氧化钛包裹竹红菌素纳米粒的制备和表征

采用溶胶-凝胶法合成二氧化钛包裹竹红菌素纳米粒,并利用透射电镜和粒度分析仪对其形貌和粒子大小进行测定,证明粒子呈球形,平均直径在100 nm左右;采用紫外和荧光光谱研究二氧化钛包裹竹红菌素纳米粒的光谱性质,并与未包裹的竹红菌素在水溶液中的光谱性质进行了比较,结果表明,竹红菌素被成功地包裹于二氧化钛纳米粒中;包裹后竹红菌素的光谱吸收峰红移,强度增加.由此,将有利于竹红菌素在光动力疗法中的应用.     

红树林土壤微生物模块化聚酮合酶基因(簇)及其多样性研究

聚酮类化合物(Polyketide)是一类重要的具有药用价值的生物活性分子.通过宏基因组学技术获得了红树林土壤微生物中模块化聚酮合酶(Polyketide Synthase,PKS)基因(簇),并对其多样性进行了研究.首先构建了该红树林土壤微生物的16SrDNA文库,初步分析了红树林土壤样本的细菌群落组成,发现许多菌群曾经被报道存在PKS基因簇,约占整个细菌群落的75%.利用相关菌群的PKS酮基合成酶结构域(Ketosynthase,KS)的保守区域序列信息设计简并引物,并构建了KS DNA序列文库.经测序获得131条新型KS序列,该结果表明红树林土壤微生物中蕴含了许多新型的聚酮类化合物合成酶.为了进一步获得聚酮合酶基因(簇),我们通过土壤微生物宏基因组Cosmid文库的构建与筛选,得到了13个属于trans-AT PKS,cis-AT PKS,NRPS/PKS Hybrid等类型的聚酮合酶的基因(簇),并通过构建KS序列的系统进化树分析了样本中聚酮合酶的多样性组成.     

纳米二氧化钛负载1,4-二羟基蒽醌的机理研究

蒽醌类化合物是天然植物药中具有重要生物活性和药效功能的物质,可用作降血糖、降胆固醇、通便利尿、抗氧化、抗过氧化、促智、抗衰老等,尤其是蒽醌类化合物还是自然界中广泛存在的一类天然光敏剂,使其在光动力疗法研究领域中受到广泛的关注.已见报道具有光敏治疗肿瘤活性的蒽醌类化合物主要有金丝桃素、痂囊腔菌素和竹红菌素等,此类药物通常以DNA为作用靶点,在光照射条件下光敏损伤DNA     

内生放线菌A00122中germicidin生物合成基因的克隆

在植物和细菌中,Ⅲ型聚酮合酶能够产生种类多样的次生代谢产物.在药用植物内生放线菌A00122的发酵产物中,分离到了一个已知的Ⅲ型聚酮类化合物germicidin.对A00122菌株建立了基因组文库,根据已知的同源基因Sco7221设计引物作为探针对文库进行PCR筛选,并通过Southern杂交的方法从阳性克隆5-3-10中定位了包含germi-cidin基因的片段,经测序得到长度为1 185 bp的完整合成基因.该基因的获得为深入研究Ⅲ型聚酮合酶的底物选择性,通过定向改造的方法获得非天然Ⅲ型聚酮类化合物提供了重要基础.     

具有抗农作物病原真菌活性链霉菌Ⅰβ1菌株的筛选鉴定及其聚酮合酶基因分析

从土壤中筛选出一株具有抗农作物病原真菌活性链霉菌,命名为Ⅰβ1.根据生理生化特性对其进行了鉴定及16S rRNA基因序列同源性比对,分析了该菌株的发酵滤液抑菌稳定性和聚酮合酶基因.结果表明:该菌株初步鉴定为链霉菌属,Ⅰβ1菌株发酵滤液在温度为-20~55℃,紫外线照射10~30 min,pH为1.0~9.0条件下均较稳定,聚酮合酶基因在其系统分类上与Streptomyces noursei ATCC 11455制霉菌素生物合成基因簇的聚酮合酶基因分枝较近.     

运动训练对大鼠肾上腺一氧化氮合酶和细胞凋亡的影响

探讨不同强度运动对大鼠肾上腺一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）和细胞凋亡的影响.采用跑台运动方式,建立大鼠有氧运动和疲劳运动模型,运用免疫组织化学streptactividin-biotin complex（SABC）法研究不同强度运动对大鼠肾上腺组织内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase,eNOS）、诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）和神经型一氧化氮合酶（Neuronal nitric oxide synthase,nNOS）及细胞凋亡蛋白（Bcl-2/Bax）表达的影响.结果表明,有氧运动组与对照组比较,肾上腺组织eNOS、nNOS、Bcl-2（B celllymphoma/leukemia-2）和Bax（Bcl-2 assaciated X protein）表达差异显著（P〈0.05）,iNOS虽略有升高,差异不显著;疲劳运动组与对照组和有氧运动组比较,大鼠肾上腺组织NOS及Bcl-2、Bax表达差异显著（P〈0.05）.表明运动可引起大鼠肾上腺NOS及Bcl-2、Bax表达的变化,且与运动强度关系密切;有氧运动可使肾上腺NOS适度增加且抑制细胞凋亡的发生;疲劳运动导致大鼠肾上腺组织NOS均过度表达,细胞发生凋亡现象.     

丙烯酰CoA合成酶在大肠杆菌中的表达及其酶活性表征

以橙色绿屈挠菌（Chloroflexus aurantiacus）dsm636基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆了丙烯酰CoA合成酶（ACS）基因,并连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建了pET-22b(+)-Acs重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+) Acs转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建了大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-Acs基因工程菌。重组菌株经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,目标条带出现在分子量约160000处,表明丙烯酰CoA合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达;体外酶活实验证明,所表达的丙烯酰CoA合成酶是具有活性的。     

庆大霉素生物合成关键酶基因在E.coli中的克隆与表达

从庆大霉素产生菌?棘孢小单孢菌基因组中扩增出参与庆大霉素生物合成的关键酶基因——2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因GntB,将其分别克隆到克隆载体pBS-T和表达载体pET-22b(+)上,并将pET-gntB转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),用IPTG诱导使GntB基因实现表达.GntB基因大小为1 193 bp,其编码的氨基酸含397个残基,约为42 kD的多肽链.     

大肠杆菌中插入表达信号肽提高吡咯喹啉醌产量的研究

本文将载体pET-22b的信号肽基因pelb插入pET-28a-pqq的T7启动子和pqq基因之间,得到重组工程菌E.coli-BL21(pET-28a-pelb-pqq),发酵生产吡咯喹啉醌（PQQ）。结果表明PQQ最高产量可达40.73mg/L,比对照菌E.coli-BL21(pET-28a-pqq)提高了24.36%。此外,工程菌和对照菌前3h发酵的单位菌体产量及单位菌体产率均较高,且此后呈下降趋势。而E.coli-BL21(pET-28a-pelb-pqq)在21h后的PQQ产量及生物量均增加,推测PQQ产量与菌体生物量之间存在同促关系。     

苹果褪绿叶斑病毒库尔勒香梨分离物外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将ACLSV CP基因克隆到表达载体ρET-28a( )中，转化大肠杆菌BL21，筛选得到阳性克隆pET-ACP，用IPTG诱导使其表达，SDS-PAGE电泳分析表明，预期的22kD外壳蛋白在大肠杆菌中得到大量表达，并加以纯化，用于制备抗血清。     

大黄欧文菌中蔗糖异构酶基因的克隆表达及应用

以大黄欧文菌(Erwinia rhapontici)NX-5基因组DNA为模板,PCR扩增得到编码蔗糖异构酶(SIase)的基因palⅠ,构建克隆载体pUC18-palⅠ。经测序正确后,将palⅠ亚克隆至表达载体pET-22b(+)上,并在E.coliBL21(DE3)中成功表达相对分子质量约为66 000的可溶性蛋白。通过Ni-NTA柱对表达产物进行纯化,纯酶的比活为40 U/mg。转化条件研究表明:重组菌能够高效转化质量分数为50%的蔗糖溶液,转化液中异麦芽酮糖得率为85%。     

噬夏孢欧文氏菌类crtB基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因crtB,编码八氢番茄红素合成酶。利用PCR技术扩增出crtB基因,克隆进表达载体,构建表达质粒pET-15bcrtB。重组质粒转化大肠杆菌,构建工程菌株。经IPTG诱导,工程菌高效表达了重组八氢番茄红素合成酶,表达量占菌体总蛋白的40%。重组蛋白以包含体形式存在,包含体经洗涤、尿素溶解、复性并经镍离子树脂亲和层析、Superdex 75凝胶层析柱纯化,得到了电泳纯的重组八氢番茄红素合成酶,带有His-tag的该蛋白分子量为35 kDa,pI值为7.3。     

豹蛙酶的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据豹蛙酶的氨基酸序列,采用大肠杆菌偏爱密码子设计引物,重叠延伸PCR法合成出目的基因,约350bp。将得到的片断克隆于载体pGEM-T中并测序,再连接至表达载体pET-22b(+)中,重组质粒转入大肠杆菌Rosetta中。转化的重组大肠杆菌用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导外源基因表达,采用Tricine-SDS-PAGE系统,分析目标蛋白主要以包涵体形式存在,其质量分数可达48.8%。利用液相电喷雾串联质谱方式(LC-ESI-MS/MS)鉴定蛋白,通过LCQ DECA XP Plus系统进行蛋白序列的分析,其覆盖率达到35%,确定了其蛋白质一级结构的正确性。     

Cry1Ab/Ac抗虫基因克隆与原核表达

针对转基因水稻TT51-1插入的Bt基因,扩增全长序列并克隆至pGEM-T载体.测序验证后利用HindⅢ与BamHⅠ双酶切将Bt基因定向插入pET-28a载体.转化重组构建的pET-28a-cry至BL21(DE3)宿主菌,在0.1mmol/L IPTG诱导下获得以包涵体形式表达的目的蛋白.经SDS-PAGE凝胶回收法获得相对分子质量约7.1×104的目的蛋白rCRY,为转基因作物检测新方法的开发提供了物质基础.     

糖多孢红霉菌酮还原酶域在羰基还原中的应用

为研究糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域,催化羰基还原的底物特异性和立体选择性,PCR扩增了该酶域的编码基因(eryKR1),并将其克隆到表达载体pET-28a,得到重组质粒pET-eryKR1,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-eryKR1).将E.coli BL21(pET-eryKR1)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示E.coli BL21(pET-eryKR1)对环己酮的还原效果较好,产物环己醇的得率最高可达93.24%,而对其他3种底物几乎没有还原能力.利用E.coli BL21(pET-eryKR1)2催化2-甲基环己酮不对称还原,产物主要为顺式-2-甲基环己醇,产率可达41.87%,产物的对映体过量值为74.81%.     

Expression, refolding and preliminary characterization of recombinant snake venom metalloproteinases: Implica- tion for the hemorrhagic mechanism

Local hemorrhage are common consequences of viperid and crotalid envenoming. Many experiments clearly demonstrated that local hemorrhage can be attributed to snake venom metalloproteinases (SVMPs), which comprise a series of zinc-dependent proteases of varying molecular masses[1,2]. More than 100 SVMPs, including the isozymes from the same species, have been isolated and the amino acid sequences of about 20 enzymes have been determined. They all contain a zinc-binding motif of HEXXHXXGX…