双分子荧光互补技术及其在蛋白互作研究中的应用

双分子荧光互补（bimolecula fluorescence complementation,BiFC）是近年新发展起来的在活细胞中研究蛋白质互作及其定位的新技术．该技术巧妙的将荧光蛋白切成不发光的两个片段,并与目的蛋白融合表达．如果目的蛋白相互作用,连接其上的荧光互补蛋白片段将会相互靠近并恢复荧光活性,从而实现了分子与细胞事件的可视化．BiFC既可以验证蛋白之间的互作、检测其互作强弱,还可以定位互作蛋白的位点．基于双分子荧光蛋白的应用已经越来越广泛,本文对双分子荧光互补技术的原理、应用现状、特点及其面临的问题进行了概述．     

可单波长激发的荧光纳米粒子的合成与表征

根据荧光共振能量转移(FRET)原理,先选定了能级匹配的给体(4-乙氧基-9-(2-羟乙基)-1,8-萘二甲酰亚胺(EHNI))和受体(硝基苯并二恶唑基染料(NBD)),采用一步细乳液聚合方法将这2种生色团引入单个的聚合物纳米粒子.制得的荧光纳米粒子兼有EHNI和NBD 2种染料的光谱特性,证明了2种生色团已经结合进入纳米粒子中.并且通过改变这2种染料的掺杂比例,在单一波长激发下,通过发生荧光共振能量转移,聚合物纳米粒子表现出多色,及可调控、可区分的荧光发射信号.     

柞蚕丝生色物与丝蛋白交联的荧光光谱法研究

本文用荧光光谱法对柞蚕人造白丝及天然黄丝进行了系统考察,发现人造白丝中生色物龙胆酸未与丝蛋白交联,而黄丝中已部分交联。交联以同样方式存在于丝胶、丝素中。并给出了可能的交联结构。     

绿色荧光蛋白结合蛋白的表达纯化与鉴定

绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物已经被广泛应用于生物化学和分子生物学研究,其纳米抗体(GBP)也已在近期被鉴定,但GBP大规模表达及纯化流程优化尚未见报道,并且GBP与不同荧光蛋白之间的亲和力尚未被测定.我们首先构建了GBP基因(GBP1)的原核表达系统,然后通过Ni-NTA亲和层析和Mono Q阴离子交换层析纯化,每升菌液能够得到超过43mg、纯度超过95%的重组GBP1蛋白.我们通过MALDI-TOF/TOF质谱法测定纯化的GBP1的精确分子量,通过微量热泳动(MST)和等温滴定量热(ITC)实验检测GBP1与7种不同来源荧光蛋白的亲和力.结果显示GBP1特异性地与源自Aequorea victoria的荧光蛋白及其衍生荧光蛋白相互作用,与RFP和Zoanthus GFP等无相互作用.GBP1与EGFP和sfGFP的亲和力最高,与YPet和T-Sapphire的亲和力稍弱,与CyPet的亲和力最低.     

拟南芥CARK4与RCAR12相互作用的研究

本研究采用酵母双杂交(Y2H)、GST-融合蛋白沉降技术(GST-pull-down)及双分子荧光互补实验(BiFC)实验方法研究蛋白质激酶CARK4与脱落酸受体RCAR12之间的相互作用.酵母双杂交(Y2H)试验显示,缺失氮端的CARK4(CARK4ΔN)与RCAR12具有明显的相互作用.体外GST-融合蛋白沉降技术试验进一步得出CARK4能拉下RCAR12,而不能结合负对照GST,这证明CARK4可以直接与RCAR12相互作用.为了确定CARK4与RCAR12在植物体内是否也存在相互作用,利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达来进行BiFC实验,结果表明在烟草中共注射CARK4与RCAR12能发激发荧光,而负对照却没有,这说明CARK4与RCAR12在植物体内存在相互作用.研究结果表明,CARK4与RCAR12在植物体内、体外均具有相互作用.     

一种检测蛋白质相互作用的双荧光共定位系统

自发荧光蛋白以快捷灵敏、即时检测和无需破坏活细胞的特点在蛋白质相互作用的研究中得到广泛应用.从发光水母Aquoria victoria中分离的绿色荧光蛋白(GFP)和从珊瑚Discosoma sp.中分离的DsRed红色荧光蛋白是自发荧光蛋白的典型代表.本研究开发一种基于GFP和红色荧光蛋白(RFP),并可通过待检测蛋白在细胞内表达的空间位移变化产生共定位的双荧光共定位检测系统.该系统为克服两种荧光蛋白光谱渗漏带来的非特异性结果的干扰,将核仁定位信号(NoLS)和出核信号(ABL)分别连接到RFP和GFP.具有定位信号的GFP和RFP的待检测蛋白对可分别在细胞核内和(或)细胞核外表达,伴随它们的相互作用,荧光共定位的现象会产生在细胞内特定的区域.利用抗凋亡蛋白Bc1-2和Bak-BH3短肽作为蛋白对测试该系统,荧光共定位现象明显,系统灵敏可靠.     

绿色荧光蛋白基因mgfp4在水稻愈伤组织中的瞬时表达

采用基因枪方法将适用于高等植物的绿色荧光蛋白基因ｍｇｆｐ４转化到水稻愈伤组织之中,获得高效瞬时表达,在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察到强烈绿色荧光。绿色荧光蛋白ｍＧＦＰ４生色团形成迅速,转化４ｈ后就能观察到绿色荧光,并且持续时间较长,２ｄ后才基本消退。     

硫代水杨酸的荧光光谱研究

探讨溶液酸度对硫代水杨酸荧光光谱性质的影响.同时,对硫代水杨酸荧光的稳定性进行了研究,考察了闭光,日光和紫外光对硫代水杨酸三维荧光光谱的影响.在1.041×10~(-3) mol·L~(-1)-5.196×10~(-3) mol·L~(-1)范围内,硫代水杨酸浓度与其荧光强度呈良好的线性关系,相关系数为0.998 8,为荧光光谱法测定硫代水杨酸提供理论依据.     

糖-量子点作为荧光探针研究糖-蛋白相互作用

糖–蛋白的相互作用在多种病理和生理过程中扮演着重要角色.借助量子点(quantum dots,QDs)优良的光学性质、巨大的比表面积和良好的生物相容性,对其表面进行寡糖修饰后得到的糖–量子点荧光探针,可以很好地模拟细胞表面的糖链结构,为糖–蛋白、糖–糖的相互作用研究提供有力工具.本文主要介绍近年来兴起的糖–量子点制备、表征及其在化学糖生物学中的应用.     

荧光淬灭法研究黑豆凝集素Ⅰ微环境与构象的关系

用KI、CsCl和丙烯酰胺对黑豆（Glycine max var.）凝集素Ⅰ(GMLⅠ)进行内源荧光淬灭研究.天然黑豆凝集素Ⅰ在280 nm波长激发下显示λmax为339 nm的内源荧光发射光谱,表明凝集素荧光生色基团位于相对疏水的环境中;3种淬灭剂对GMLⅠ的荧光淬灭属于动态淬灭机制.GMLⅠ分子的生色基团Trp残基对中性淬灭剂丙烯酰胺的可接近程度为100%,而对阴离子淬灭剂KI的可接近程度为81.6%,对阳离子淬灭剂CsCl的可接近程度为52.8%,表明GMLⅠ中大部分Trp残基位于分子表面或近表面,只有小部分包埋于分子内部的疏水性环境中,并且Trp残基周围所处微环境带正电荷的比例比带负电荷的比例高.     

新氨基标记试剂的合成、表征及荧光性质

以荧光素为荧光团,N-羟基琥珀酰亚胺为活性基团,合成了一种新的氨基荧光标记试剂6-氧-(N-琥珀酰亚胺乙酸脂)-9-(2′-乙氧羰基)荧光素(SAAF),对其结构进行表征,并研究和测定了SAAF的荧光性质以及在不同介质中的荧光量子产率.结果表明SAAF的荧光强度受pH值影响较小,光稳定性好.与已有的商品化试剂相比,具有优势和特色.     

一种荧光增强型的GSH荧光探针

常见的生物硫醇包括半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)以及谷胱甘肽(GSH),它们在人体中起着十分重要的作用.使用荧光探针检测此类生物硫醇具有灵敏度高、选择性好、响应时间快等优势.由于3种硫醇具有相似的化学结构(含有活性巯基),因此给这类生物硫醇的选择性检测带来挑战.本文设计了一种荧光探针(2-甲基,6-丙烯酰基喹啉)用于区分检测GSH和Cys/Hcy.通过测试该探针的光谱性质,发现在含有该探针的水溶液中加入谷胱甘肽(GSH)后,相应的荧光光谱和紫外-可见光谱都有显著的变化.相比其他分析物,发现探针在水溶液中对GSH具有较高的选择性和灵敏度.此外,考虑到该检测过程是在水相中进行的,因此该探针在生物成像方面具备潜在的使用价值.     

新型荧光探针化合物的合成与光谱性质研究

合成了5种2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类荧光化合物,对所合成的全部化合物的结构进行了光谱表征;研究了合成的2-(2-羟基苯基)苯并咪唑类化合物的荧光性质;探讨了不同取代基对化合物的荧光强度,荧光波长,斯托克斯位移,荧光量子收率等荧光参数的影响.     

含苝聚几内酯荧光微球的制备及其用于细胞荧光成像的研究

本论文首先以苝二酸酐和二甘醇胺为原料合成得到了苝酰亚胺羟基衍生物(PBI-OH),再以PBI-OH作为引发剂引发ε-己内酯开环聚合,得到了具有荧光性的含苝聚己内酯(PBI-PCL). PBI-PCL的结构采用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和核磁共振氢谱(1H-NMR)来确定,其光学性质采用紫外吸收光谱(UV-Vis)和荧光激发光谱(FL)来表征.随后将PBI-PCL采用乳化-溶剂挥发法将其制备成纳米微球,并采用激光粒度仪对其粒径和分布进行表征.以该微球为荧光标记物,分别对L929和Hela细胞进行荧光标记研究.综上,PBI-PCL是一种具有优良自荧光性能的可降解聚酯材料,其纳米微球可作为多种细胞的荧光标记物使用,有望成为一种有竞争力的荧光标记材料.     

铕一丙烯酸一邻菲罗啉三元配合物的合成及荧光性质研究

合成了铕(I)-丙烯酸-邻菲罗啉三元配合物,通过元素分析、红外光谱、热重分析和荧光光谱研究了配合物的组成、结构和性质,荧光光谱表明该配合物具有很好的荧光性质.     

2-(2′-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物的合成及荧光性质

合成了4种2-(2′-羟基苯基)苯并咪唑类衍生物,并对其结构进行了表征;研究了衍生物的荧光性质及互变异构体对荧光量子产率的影响;探讨了不同的取代基对荧光性质的影响,得出吸电子取代基使荧光量子产率减小的结论.     

基于荧光蛋白的防晒剂研制

为分析湛蓝色荧光蛋白(marine fluorescent protein,MFP)作为蛋白防晒剂的可行性,通过PCR定点突变、原核表达和亲和层析纯化获得MFP,并通过UVB紫外线照射大肠杆菌存活实验初步分析了MFP吸收紫外线的能力,采用噻唑蓝法(thiazolyl blue tetrazolium bromide assay,MTT法)分析了MFP对细胞的毒理性.结果表明:MFP将250～400 nm波长的紫外线吸收后释放的荧光波长大于400 nm,吸收峰波长为280 nm(ε_(max280)为3.27×10~4 L·mol~(-1)·cm~(-1))和365 nm(ε_(max365)为1.54×10~4 L·mol~(-1)·cm~(-1));在大肠杆菌内表达MFP可提高菌株抗紫外线的能力;c_(MFP)5μmol/L时,MFP对TL-Om1细胞株基本没有毒性.因此,MFP可作为广谱防晒剂应用于防晒霜和防晒喷雾等,该结果为蛋白类防晒剂的开发奠定了一定的理论基础.     

离心静电纺丝法制备有序、交叉以及绞线结构的荧光纳米纤维

利用新型低压离心静电纺丝法制备了有序排列、交叉排列以及绞线结构的荧光纳米纤维(掺杂荧光物质为荧光素和罗丹明B)。利用扫描电镜(SEM)、荧光显微镜和荧光光谱仪对纤维的微观形貌和荧光性质进行了表征和测量,结果显示,绞线结构的荧光强度较单根纤维组合大大加强。     

水溶性聚对芳撑乙炔在传感中的荧光猝灭

具有较高荧光量子产率,并且在水溶液中聚集很弱的阳离子型水溶性聚对芳撑乙炔(P1)是一种潜在的高灵敏荧光传感材料.通过比较研究多价无机抗衡离子和具有表面活性剂性质的抗衡离子对P1聚集态的影响,以及P1与3个具有相似结构的有机小分子猝灭剂之间的荧光猝灭效应,深入探讨了水溶性共轭聚合物荧光猝灭传感的猝灭剂构效关系.