纳豆激酶基因导入番茄的研究

将来源于枯草芽孢杆菌的纳豆激酶(nattokinase,NK)基因转化到人类可以直接食用的,又非常喜爱的蔬菜—番茄中,得到在转录水平表达的转基因植株.通过根癌农杆菌EHA105介导,转化番茄的下胚轴,诱导愈伤组织形成及分化成幼苗,进而再生出完整植株.提取再生植株基因组DNA,通过PCR扩增检测,结果表明纳豆激酶基因已经成功整合到番茄植物基因组中.RT-PCR实验结果证明了纳豆激酶基因在转录水平上有表达.     

纳豆杆菌纳豆激酶成熟肽基因的克隆与同源性分析

纳豆杆菌 (Bacillusnatto)是从日本传统食品纳豆中筛选出来的 ,它具有较强的溶栓作用 .根据已发表的纳豆激酶基因序列设计一对引物 ,利用聚合酶链式反应 (PCR) ,从纳豆杆菌的基因组DNA中扩增和克隆到纳豆激酶基因 .序列分析表明 ,该纳豆激酶基因成熟肽编码区含有 82 5bp ,编码 2 75个氨基酸残基 ,与文献已报道的序列分别有 93.4 %和 94 .5 %的同源性 ,显示了极高的同源性 .但该基因与该室克隆的豆豉溶栓酶基因的同源性仅为 80 .1%,这表明纳豆激酶与豆豉溶栓酶确实不是同一种酶 .     

纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌中活性表达研究

以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增了纳豆激酶基因（natto kinase gene）中编码前肽、成熟肽的核苷酸序列（pro-NK），构建大肠杆菌表达质粒pTYB102，转化大肠杆菌ER2566。在IPTG诱导下，分别在15℃（14h）、30℃（3h）、37℃（2h）条件下培养，pTYB102均能表达出有活性的纳豆激酶。实验证实纳豆激酶基因得到活性表达需要Pro序列。SDS－PAGE表明，15℃和30℃和37℃培养表达的杂蛋白更少。薄层扫描测定表达的纳豆激酶占菌体总蛋白30％以上。     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。国内外许多学者对该酶进行了基因工程研究,但在克隆表达过程中出现了许多长短不同的基因片段。本研究通过原产日本的优质纳豆中分离鉴定出高产纳豆杆菌N07并提取该菌株的全基因组;通过PCR手段扩增出能编码纳豆激酶信号肽,前导肽和成熟肽的前纳豆激酶酶原基因NK1,以及能编码纳豆激酶成熟肽的纳豆激酶基因NK2,构建了纳豆激酶基因的表达载体pET30a-NK1和pET30a-NK2,转化E.coli BL21后在大肠杆菌中表达,并进行了活性分析。结果发现,纳豆激酶酶原基因片段NK1能成功表达出有活性的分泌型纳豆激酶;而纳豆激酶基因片段NK2的表达产物为无活性的包涵体。在对NK1和NK2的比较研究后可知,纳豆激酶酶原基因片段NK1能在大肠杆菌中很好的分泌表达,这将为纳豆激酶基因工程的深入研究奠定基础。     

纳豆激酶基因重组表达载体的构建及其稳定性

利用PCR方法从分泌纳豆激酶的纳豆杆菌基因组DN中扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到表达载体PBV220上,筛选重组子,通过限制性内切酶和PCR技术分析,初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因,用凝块溶解时间法（CLT）测出表达产物具有溶解血栓活性,证明该基因可在大肠杆菌中表达,对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究,结果表明质粒的插入对宿主菌的生长没有太大影响,该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性,但结构稳定性较差,SDS-PAGE分析结果表明基因产物为分泌型,蛋白表达量占菌体蛋白的12%左右。     

地衣芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据已发表的Bacillus licheniformis植酸酶基因DNA序列(13eneBank AF469936),设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以地衣芽孢杆菌AB91062的总DNA为模板,扩增出了植酸酶基因phyL的编码区,并将其克隆到pMD18-T载体上,进行了序列测定,测序结果经Genetool序列分析表明该基因编码区长1146bp,编码381个氨基酸,与已发表的Bacillus lichenjformis植酸酶基因序列在核苷酸水平上与所发表的序列有92％的同源性;在氨基酸水平上与已发表的衣芽孢杆菌植酸酶相似性为93％．并将该基因编码区克隆到大肠杆菌表达质粒pHBM625上,并在大肠杆菌中实现了高效表达,表达产物具有正常的生物学活性．     

密码子优化的纳豆激酶基因在番茄果实中的瞬时表达

根据植物偏爱密码子设计并人工合成了纳豆激酶基因sNK,在其中插入番茄内含子构成sNKi基因.将这两种基因通过农杆菌渗透法在不同成熟时期的番茄果实中实现了瞬时表达.通过实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)比较两种基因在番茄果实中转录水平的表达量,通过纤维蛋白平板法检测两种基因表达产物的纤溶酶活性.结果表明,两种基因在番茄果实的转色期、成熟期和完熟期均有表达,其中成熟期表达量最高,破色期基本无表达.果实特异性E8启动子调控下的纳豆激酶基因的表达量较组成型35S启动子调控下的该基因表达量明显提高.插入内含子的sNKi基因的表达量高于没有内含子的sNK基因,表明内含子在提高纳豆激酶的表达量方面具有显著的作用.     

枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆及其在E.coli BL21(DE3)plysS中的表达

用CTAB法从枯草杆菌(纳豆株)中提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增获得837bp的DNA片段,将该基因片断克隆到pMD18-T载体上,筛选重组子,通过限制性内切酶、PCR技术和测序分析确定该重组子所含插入片断为纳豆激酶基因．利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的融合表达载体,转化E．coli BL21(DE3)plysS后经IPTG诱导在大肠杆菌中高效表达,经SDS—PAGE电泳及bandscan软件分析融合蛋白分子量约为33．4kD,约占菌体总蛋白29．4％．     

辐照灭菌用于纳豆激酶制剂的实验研究

对60钴γ-射线辐照前后的纳豆激酶(NK)制剂有效成分、酶活及活菌数等技术指标进行了实验研究,结果表明,不同剂量的60钴γ-射线辐照对纳豆激酶制剂中的总皂甙含量和纳豆激酶酶活影响不大,30 kGy时总皂甙含量仍可达到原始含量的105%～125%,NK酶活达到原始酶活的90%以上;纳豆芽孢杆菌、大肠菌群和金黄色葡萄球菌等活菌数对60钴γ-射线辐照十分敏感,5 kGy的60钴γ-射线辐照处理后纳豆芽孢杆菌、大肠菌群和金黄色葡萄球菌数量下降99%以上.     

纳豆激酶的高效表达研究进展

心血管疾病(cardiovascular diseases,CVDs)已成为影响人类健康的主要疾病.纳豆激酶(nattokinase,简称NK)是一种由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分泌表达的碱性丝氨酸蛋白酶,具有较强的溶栓活性.文章主要就NK溶栓机理、高效表达方面进行论述,简要概述近年来NK高效表达研究进展,并对未来NK发展趋势进行展望.     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.     

豆豉生产中高大毛霉和纳豆芽孢杆菌 HT8 共发酵条件研究

通过实验室人工模拟条件，把豆豉感官、生长和纳豆激酶活性作为评判标准，首先采用单因素实验探索了豆豉生产中高大毛霉和纳豆芽孢杆菌 HT8 共发酵的接种量、菌种比例、接种时间和发酵温度 4 个单因素的最佳条件，然后通过正交实验探索了这 4 个因素的联合最佳条件。结果表明，高大毛霉和纳豆芽孢杆菌共发酵的最佳接种量为 4%，菌种比例为10:1，培养温度为25 ℃，发酵时间为56 h；在此条件下毛霉生长繁茂，豉香浓郁，且纳豆激酶活力达1 092.71IU mL-1。高大毛霉和纳豆芽孢杆菌 HT8 混合发酵在保持豆豉原有风味的同时丰富了发酵产生的蛋白酶系，使之具有纳豆激酶活性，为新型保健食品的开发提供了新思路。
     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.     

角蛋白酶基因kerB的提取、 克隆及表达

从角蛋白酶产生菌株地衣芽孢杆菌L-25中提取基因组DNA， 借助特定引物通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到kerB基因片段. 扩增后的kerB片段通过分子生物学方法克隆 到产酶缺陷型枯草芽孢杆菌DB104菌株敏感细胞中进行表达. 结果表明， 表达成功的FD-8菌 株（DB104/pLK18）可以在羽毛培养基上生长并完全水解羽毛.     

苏云金芽孢杆菌BtR05普鲁兰酶基因pul在重组大肠杆菌中的自诱导表达

以苏云金芽孢杆菌BtR05基因组DNA为模板,PCR扩增得到其普鲁兰酶基因pul,构建了表达载体p ET(K)-Trx-pul,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中。用IPTG和自诱导表达系统分别对该酶基因进行诱导表达。Tricine-SDSPAGE结果表明,普鲁兰酶基因pul可通过自诱导获得大量表达。     

枯草芽孢杆菌ATCC21216腺苷磷酸化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增枯草芽孢杆菌ATCC21216(His-)编码腺苷磷酸化酶的基因deoD(0.7 kb),测序表明与枯草芽孢杆菌168的deoD同源性为98.7%。将此基因插入质粒pET28a( )(5.3 kb)中,重组质粒pETdeoD在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达,表达量占总蛋白的27%。以HPLC方法测定腺苷磷酸化酶的比酶活为每毫克蛋白0.151 U。     

纳豆芽孢杆菌的相关研究进展

纳豆芽孢杆菌是一种好氧型革兰氏阳性益生菌,具有较强的热、酸碱稳定性,进入肠道后迅速发育成营养性细胞,抑制肠杆菌、肠球菌、致病菌等的生殖,促进双歧杆菌、乳酸杆菌和梭菌等厌氧菌的生长,调节微生态平衡,代谢分泌出多种促进营养物质消化吸收的酶类,强化消化机能,同时刺激机体内的免疫系统产生干扰素等抗菌物质和高强溶栓功效的纳豆激酶,增强动物细胞免疫功能.纳豆芽孢杆菌可作为天燃防腐剂、微生态制剂、饲料添加剂、酶活性增强剂、免疫增强剂,提高食品的保藏期、动物的日增重和产奶率,运用到水体中可起到净化水质、改良底质等的作用.本文对纳豆芽孢杆菌的菌落结构、生长曲线、发酵产物及其功能应用进行综述,为充分发挥纳豆芽孢杆菌的功能,生产新型绿色国民生活所需品,降低生产成本提供理论支撑.     

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达

在克隆、表达纳豆激酶基因的基础上,对IPTG浓度以及诱导时间两个重要影响因子进行优化选择.结果表明,在IPTG 100μg/mL诱导2.5h时,纳豆激酶的表达量相对较高,约占菌体蛋白重量的46.63%,为实验最佳的诱导条件.     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。