基于转座子策略提高链霉菌中landomycin E产量的研究

【目的】对影响放线菌链霉菌Streptomyces globisporus产landomycin E(laE)的代谢网络进行研究,以提高次生代谢物的产量。【方法】通过构建含强启动子和抗性标记的转座子Tn7为基础的转座子,整合至S.globisporus的染色体产生突变库,筛选高产量的突变株并对其代谢网络进行研究分析。【结果】利用构建好的Tn7-转座子连续转化链霉菌S.globisporus,经过数轮的突变和筛选,得到6株产量有较大改变的突变株,对整合位点的亚克隆和测序结果表明,该位点整合导致编码类似细菌的某些调节因子如TetR和GntR家族的蛋白的基因失活。【结论】所构建的经过修饰的微型Tn7-转座子不仅带有抗性标记且有启动子,可插入链霉菌染色体产生突变,进而提高次生代谢物laE的产量,同时也证明,转座子基载体可应用于非模式菌链霉菌。     

Red/ET重组AHBA生物合成基因簇打靶载体的构建与鉴定

为确定3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)生物合成基因簇在链霉菌中与次生代谢产物的关系,运用PCR技术,从33株AHBA合酶基因阳性菌株扩增与AHBA生物合成基因簇中编码AHBA合酶(A)、氧化还原酶(O)、磷酸化酶(P)基因,获得24株AOP基因阳性菌株.根据靶基因A基因下游和P基因上游同源序列设计50 bp引物,中间插入卡那霉素抗性基因的DNA片段,进行PCR,获得外源DNA片段.经过电转化,将外源DNA片段和pKC1139-AOP重组质粒共转入含重组酶质粒大肠杆菌HS996/ pSC101-BAD-gba-(Tet).在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与重组质粒pKC1139-AOP上的AHBA基因簇的同源区域重组,构建了AHBA基因簇打靶载体.研究显示了Red/ET重组工作效率高、操作简单、精确的优点,可大大缩短构建打靶载体的时间.     

扩增ccaR基因提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究

在棒状链霉菌B71-14中扩增对克拉维酸具有正调控作用的基因ccaR,构建了ccaR的重组质粒pSET152-ccaR,通过接合转移将重组质粒pSET152-ccaR转入了S.clavuligerus B71-14中,通过pSET152-ccaR中的attP位点整个质粒插入到S.clavuligerus B71-14基因组中的attB位点,实现了S.clavuligerus B71-14基因组DNA中增加一个拷贝ccaR基因的目的,所得突变株S.clavuligerus::ccaR产酸量可达820.91mg/L,较出发菌株提高了54%.     

曲张链菌素产生菌壮观链霉菌NRRL2494菌株遗传操作体系的建立

曲张链菌素属于安莎类抗生素,具有显著的生物活性.在从壮观链霉菌NRRL2494菌株的发酵产物中分离和鉴定了多组分曲张链菌素的基础上,探索和优化了外源DNA通过接合转移进入壮观链霉菌NRRL2494菌株的操作方法和培养条件.以游离型质粒pJTU1278为载体,在体外构建了一个曲张链菌素酰胺合酶基因svaF敲除的质粒,通过接合转移转入到壮观链霉菌NRRL2494野生型菌株中,所获得的svaF基因缺失突变株失去了产生曲张链菌素的能力.该遗传操作体系的成功建立和优化,使得在体内分析和鉴定曲张链菌素生物合成基因的功能成为可能,同时也为建立其他类似放线菌的遗传操作体系提供了参考.     

阿维链霉菌中转录因子AveR对阿维菌素生物合成的正调节

aveR是阿维链霉菌NRRL 8165阿维菌素生物合成基因簇中唯一可能的调节基因.为了验证aveR是否参与阿维菌素生物合成基因的转录调节,构建了用于敲除aveR的基因置换质粒pJTU2530,并通过接合转移引入了阿维链霉菌.通过筛选ThioSAprR转化子,经聚合酶链式反应(PCR)扩增验证,获得了aveR内部1 320 bp区域被阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV替换的突变株ZD10.高压液相色谱检测表明,与野生型菌株相比,突变株ZD10不再产生阿维菌素,并且ZD10中寡霉素的产量明显高于野生型菌株.进一步的反转录PCR(RT-PCR)分析表明,与野生型菌株相比,突变株ZD10的聚酮合酶基因aveA3不再转录.结果显示,AveR是阿维菌素生物合成的正调节因子,通过调节结构基因的转录表达来影响阿维菌素的产生.     

对氨基苯甲酸生物合成基因pabAB的缺失对抗生素FR-008生物合成的影响

抗生素FR-008是由链霉菌FR-008产生的一种七烯大环内酯类抗真菌抗生素,它以对氨基苯甲酸(PABA)为起始单位,在I型聚酮合酶(PKS)的催化下合成聚酮内酯环.前期生物合成基因簇序列测定发现了可能的对氨基苯甲酸生物合成基因(pabAB),编码4-氨基-4-脱氧-分支酸(ADC)合成酶.通过同框缺失实验获得pabAB发生缺失的基因置换突变株BLQ-1并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增进行了验证.高效液相色谱(HPLC)分析和生物测定证实突变菌株BLQ-1丧失了合成抗生素FR-008的能力.这种产量的丧失可以通过回补克隆的pabAB基因或喂养外源PABA得到回复.实验证明,pabAB负责对氨基苯甲酸的合成,是抗生素FR-008生物合成的必需基因.     

一株高效抑藻放线菌的分离筛选及鉴定

从福建云霄国家红树林自然保护区滩涂沉积物样品中,共分离获得521株纯培养物.通过检测球形棕囊藻(Pha-eocystis globosa)荧光强度计算抑藻率,从521株菌中筛选到27株具有抑藻活性的菌株.在27株抑藻菌中,菌株O3-26对球形棕囊藻具有最高的抑藻率(高达96.71%).菌株O3-26的抑藻谱实验显示,该菌株抑藻活性表现出一定的种属特异性,对硅藻门(Bacillariophyta)的三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)和中肋骨条藻(Skeletonema costatum)2株测试藻株没有抑制作用,而对绿藻门(Chlorophyta)盐生杜氏藻(Dunaliella salina)和自养小球藻(Chlorella autotrophi-ca)2株藻株具有较强抑藻作用.扫描电镜观察显示,该菌株孢子丝直至螺旋状且孢子表面带刺.生理生化实验显示,该菌株在所得到的大多数培养基上生长良好,在营养琼脂培养基中可以产生水溶性色素;不能在棉子糖作为唯一碳源的培养基上生长.16SrRNA基因相似性分析表明,菌株O3-26属于链霉菌属(Streptomyces),并与灭癌素链霉菌(Streptomycesgancidicus)15412菌株具有最高的同源性(99%).生理生化实验表明,二者之间生理特征存在一定差异.综合形态特征、生理特征以及系统发育分析的结果,鉴定该菌株为灭癌素链霉菌.     

插入Tn21质粒的分离和链霉素抗性基因质粒的组建

在携带R100.1和pSO101质粒的Lc2640细胞中分离到重组质粒pXZ2712,该质粒对链霉素、氯化汞、磺胺和四环索有抗性。用仅带有Tn21两个末端的质粒pXZ2作为探针进行分子杂交,发现两者有同源性,说明质粒pXZ2712是由Tn21插入质粒pSC101所组成的。以pXZ2712质粒中分离到的带有链霉素抗性基因的片段,组建了带有抗链霉素基因的pXZ6(14.5kb)、pYP1(9.7kb)、pYP22(9.1kb)和pYP4(4.0kb)等质粒载体。     

Tn5转座子插入p95基因不影响AcMNPV的复制

从Tn5转座子介导的AcMNPV随机插入突变体库中,分离到一株复制正常的突变体AcApra41.突变定位发现Tn5转座子插入了病毒p95基因中.为了排除AcApra41中还有其他突变,利用同源重组法构建了p95基因定点插入突变的重组病毒AcGFP-P95in.PCR确认p95基因中插入了Tn5转座子;Western blot也证实AcApra41和AcGFP-P95in感染的细胞中,P95蛋白的分子量都因为插入突变而变小,由野生型的95 ku变为 55 ku.病毒复制动态曲线和荧光显微镜观察证实带有该插入突变的病毒能够在Sf9细胞中正常复制,并表达极晚期基因.这一结果表明完整的P95蛋白对病毒复制是非必须的.     

链霉素抗性突变理性筛选链霉素高产菌株

以灰色链霉菌(Streptomyces griseus) CICC11002为出发菌株,采用紫外诱变并结合链霉素抗性筛选法育种,以期获得高产菌株.灰色链霉菌孢子悬液经90％紫外致死剂量诱变后,在含有链霉素最小抑制浓度(0.8μg/mL)的培养基平板上,分离得到105株链霉素抗性突变菌.其中链霉素产量高于出发菌株的有19株,正突变率高达18.1％,同时获得了产链霉素能力约为出发菌株2倍的突变株SM-55.     

一株耐盐性链霉菌的鉴定及其抗菌活性

从厦门海岸潮间带红树林根系海泥分离到一株链霉菌S-111-9,能在含6～8％NaCl的高氏合成一号琼脂上生长;产生对革兰氏阳性、阴性细菌、酵母菌及霉菌有较强抑制作用的抗生素,其孢子丝直至波曲,偶而有螺旋,孢子圆柱形,表面有皱折;气生菌丝浅粉红色;基内菌丝褐色,无可溶性色素,该菌应归入链霉菌属(Streptomyces)粉红孢(Roseosporus)类群,而形态和生理特征与该类?的相近种华美链霉菌、玫瑰褐链霉菌和烟薰链霉菌有显著差别,可认为是一新种,?定名为厦海链霉菌(Streptomyces xia-baiensis n.sp.Zhou)。     

溴乙啶对禾粟链霉菌(105N_1)质粒的消除作用

禾粟链霉菌(105N_1)是于1977年,从广东省,海南岛灰土壤中分离的。 Strpetomyces graminearus 105N_1具有产生抗生素和形成孢子的能力;用2×10~(-5)M浓度的溴乙啶(Ethidium bromide)处理后,则丧失了产孢和形成抗生素的能力;其消除率为2.3—5％。筛选到的突变株E—16,不产抗生素,孢子光秃型。E—16菌株传代58次,性状稳定,在分得的3.1×10~5个菌落中形态纯一,未见回复突变。在琼脂糖电泳上,105N_1可见质粒带,而E—16则消失了。所有这些,初步证明了Streptomyces graminearus 105N_1具有质粒,它的质粒可能控制着孢子和抗生素的产生。     

一株具抗菌活性放线菌菌株YIM31249~T的分离和鉴定

从云南洱源采集的土壤样品中分离到1株链霉菌YIM31249TT.该菌株具有很强的抗菌活性.通过对其进行的包括形态、生理生化特性、细胞壁化学组份以及16SrDNA序列等方面的研究,确定其为链霉菌属的一个亚种,我们将其命名为生黑孢链霉菌洱源亚种(Streptomycesmelanosporofacienssubsperyuanensis).菌株YIM31249T气生菌丝和基内菌丝均很丰富,孢子链较长且为螺旋状,部分孢子链螺旋成假孢囊,孢子表面粗糙不带刺,基丝不断裂.     

抗真菌抗生素高产菌株的推理选育及其发酵调控研究

探讨海洋霉菌M182菌株对自身次生代谢产物－抗真菌抗生素M182A抗性与该抗生素产量的关系;通过亚硝基胍、亚硝基胍加紫外线复合处理,选育到对该抗生素抗性有明显提高和抗生素发酵相对效价提高到244％的高产突变菌株。稳定性实验表明该突变株遗传稳定性良好。在液体发酵中,利用天然有机营养物质发酵效果优于合成化合物。合适的温度刺激能促进该物质的形成。     

井冈霉亚基胺A高产突变株的构建

通过接合转移将一个带有阿泊拉抗性基因和双交换臂的穿梭质粒pJTU609导入井冈霉素高产菌株吸水链霉菌井冈变种(Streptomyces hygroscopicus var.jinganggensis)DX546中,将负责井冈霉素A生物合成最后一步糖基转移中的糖基转移酶基因valG置换突变,多聚酶链式反应结果显示valG被阿泊拉霉素抗性基因成功置换,通过高压液相色谱检测证实突变株的发酵产物中井冈霉亚基胺A的产量得到大幅提高.     

深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因敲除及鉴定

以产油丝状真菌深黄被孢霉M6-22(Mortierella isabellina 6-22)为出发菌株,利用亚硝基胍诱变技术筛选到一株对潮霉素药物敏感的菌株Mortierella isabellina 6-22-4,同时构建了含有潮霉素抗性基因表达单元和深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因5'与3'端部分同源序列的重组质粒PD4MI6,用于对深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基鼠的敲除.通过PEG/CaCl2介导的原生质体转化法,将质粒PD4MI6转化入深黄被孢霉M6-22-4菌株.转化子经潮毒素抗性选择平板筛选、分子检测获得了一个△6-脂肪酸脱氢酶基因缺失的突变株Mut6.气相色谱分析结果显示,该突变株γ-亚麻酸特征峰消失,相应地亚油酸产量显著增加.培养结果表明该突变株的菌落形态、颜色及生长状况与出发菌株M6-22或M6-22-4相比均有显著改变.     

一个诱动接合性柯斯载体的构建及其应用

用ｐＨＺ１３２在大肠杆菌中构建基因文库,并用特异的探针进行菌落杂交获得了有意义的ＤＮＡ片段,可将其衍生质粒转化到携带接合性大肠杆菌质粒如ＲＰ４的细胞中。通过与萌发后的链霉菌孢子进行两亲本杂交,或将携带ｐＨＺ１３２的大肠杆菌细胞和携带ＲＰ４衍生质粒ｐＰＫ２０７３的大肠杆菌细胞与萌发后的链霉菌孢子混合起来进行三亲本杂交,在接合性质粒ＲＰ４的转移功能的诱导下,携带插入片段的ｐＨＺ１３２衍生质粒即可转移到     

结核分枝杆菌标准株mazEF6缺失株的构建

为构建结核分枝杆菌标准株H37Rv毒素-抗毒素系统maz EF6基因缺失突变株。采用聚合酶链反应(PCR)技术,分别从H37Rv和PUC-19K质粒上扩增出maz EF6基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan基因;应用融合PCR技术将maz EF6基因的同源臂和kan基因进行杂交拼接,获得目的融合片段,并将该融合片段克隆于p MD-19T(simple)载体形成自杀质粒p MD-19T-Δmaz EF6-kan,将构建的自杀质粒转化至大肠杆菌DH5a中;利用电穿孔技术将自杀质粒电转至H37Rv标准株中;并将该菌株涂于卡那霉素抗性改良罗氏培养基,培养3-4周后,刮取能在卡那霉素抗性培养基中生长的结核分枝杆菌单个菌落,以提取的阳性菌株全基因组DNA为模板,PCR扩增克隆片段,并测序。对所获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株进行遗传稳定性检测。结果显示,该缺失株在15代内未发生回复性突变,成功获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株。由此可知,本研究为今后研究毒素-抗毒素系统maz EF6基因的生物学功能奠定基础。     

胰凝乳蛋白酶抑制剂A、B和C的研究——Ⅰ.产生菌的分类鉴定

从福建师范大学校园土壤中分离到一株胰凝乳蛋白酶抑制剂产生菌213—4。它的孢子丝单叉分技,形成螺旋。孢子呈椭圆形,表面呈不规则突起、疣状。经形态、培养特征和生理生化特性等的研究和比较,认为213—4菌株是吸水链霉菌的一株变种,定名为吸水链霉菌抑糜酶剂变种(S. hygroscopicus Var. Chymostaticus n. Var)。     

水稻白叶枯病菌致病相关基因筛选系统的建立

水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae是水稻生产中最严重的细菌性病害之一。本研究采用Tn5转座子随机插入突变的方法构建水稻白叶枯病菌广西菌株K74的突变体库,Southern杂交显示Tn5随机单拷贝插入基因组。通过水稻致病性检测试验,目前获得15个致病力降低50%以上的突变体,为定位Tn5插入突变基因,经质粒拯救、测序、序列分析后发现:4个突变基因为gum基因簇基因,5个为LPS基因簇基因,2个为metB基因,1个为hrpB1基因,2个是与糖合成转移酶相关基因,1个为编码假定蛋白的基因。其中14个突变基因是已知的与致病相关的基因。实验结果表明本研究成功建立了一个筛选水稻白叶枯病菌致病相关基因的系统,为进一步研究水稻白叶枯病致病相关基因,阐明该病的致病机理奠定基础。