建立一个基于报告基因的靶标筛药系统筛选上调ABCA1基因转录的中药提取物

ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)具有催化外周细胞过量胆固醇和磷脂外向流出的功能。本实验将ABCA1启动子序列克隆到含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,并将得到的重组质粒pGL3B-neo/ABCA1转染入人肝癌细胞(hepG2)。通过稀释培养法最终得到含有重组质粒的稳定细胞系SABCA1。利用这个报告基因为基础的药物筛选系统,筛选了100多种中药提取物。通过荧光素酶活性测试,相对活性达到180%以上的有4种中药提取物,并最终挑选能明显激活ABCA1基因启动子的鬼箭羽水提组分进一步研究,得出半数有效浓度(EC50)为48.06 mg/L。此外,利用基于apoA1基因的药物筛选系统验证得出鬼箭羽水提组分也能促进apoA1基因的表达。     

pGL3-4×PRE-E4-luc报告基因质粒的构建及在p44信号通路中的应用鉴定

p53基因是一种重要的抑癌基因,其产物能够与靶DNA特异性结合并激活转录参与诱导细胞凋亡,调控细胞周期,控制细胞的增殖与分化.p44蛋白主要定位于前列腺癌细胞的细胞质,促进癌细胞的增殖.通过shRNA沉默p44的表达后,LNCaP细胞的生长受抑制, p53靶基因TIGAR和GLIPR1的表达增加.为探寻p53是否介导p44对TIGAR和GLIPR1的作用,本研究构建了pGL3-4×PRE-E4-luc报告基因质粒,并将其分别转染经NT-shRNA慢病毒和p44-shRNA慢病毒感染的LNCaP细胞,比较两者荧光素酶活性.结果显示,重组质粒pGL3-4×PRE-E4-luc构建成功,为进一步研究p53在肿瘤发生发展过程中的作用通路提供了新的手段.但LNCaP细胞中p44并非通过p53作用于TIGAR和GLIPR1基因,具体机制仍有待进一步研究.     

毕赤酵母中人Ⅲ型胶原蛋白α链与病毒羟脯氨酸酶的共表达

将人Ⅲ型胶原α链与一种来源于病毒的4-羟脯氨酸酶在毕赤酵母中共表达,以获得能满足应用需求的羟基化胶原蛋白。分别构建包含酶与胶原基因的重组质粒p PICZBL593和pPIC9K-COL3A1,并将质粒均转入毕赤酵母GS115中以表达这两种蛋白。质粒测序结果表明目的基因成功插入到载体中;实时定量PCR结果显示两种基因均在mRNA水平表达;SDS-PAGE和Western Blot进一步证实两种蛋白在毕赤酵母GS115中的成功表达;氨基酸组成分析和质谱结果证实表达的胶原中含有羟脯氨酸。获得羟基化的胶原蛋白。     

TNFα基因在小鼠成纤维细胞L929中的调控研究

质粒pEGFP-1是一种不含启动子序列的哺乳动物细胞表达载体，将系列缺失的TNFα基因启动子5‘UTR（untranslated region）和3‘UTR插入pEGFP-1中，构建了一组重组质粒，转染L929细胞后，发现当报告基因EGFP的上游含有包括5‘UTR在内的TNFα基因启动子序列时，重组质粒在L929细胞中均能表达EGFP，但是，当EGFP基因3‘端同时含有TNFα基因的3‘UTR时，重组质粒转染L929细胞后，均不能表达EGFP，因此，在L929细胞中，TNFα基因的3‘UTR对基因表达具有抑制作用，进一步研究发现，在L929细胞中，TNFα基因的3‘UTR对基因表达的抑制作用需要其5‘UTR的共同参与，而且，RT－PCR实验表明，LPS在其他细胞中对TNFα基因起诱导作用的机制在L929细胞中不存在。     

胞壁形式表达融合蛋白Der p2-PEB1重组BCG的构建和鉴定

利用重组BCG技术,构建能以胞壁形式表达屋尘螨Der p2和PEB1抗原的重组BCG口服哮喘疫苗pCW-Der p2-PEB1-rBCG,以pCW-Der p2质粒和pUC-PEB1质粒DNA为模板扩增基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1.将重组质粒电穿导入BCG感受态细胞,潮霉素抗性筛选rBCG阳性克隆.阳性rBCG经PCR特异性扩增目的基因片段Der p2及PEB1,证实其中含有目的基因.用抗Der p2单克隆抗体和制备的小鼠PEB1抗血清对rBCG进行间接免疫荧光鉴定.结果成功扩增了Der p2及PEB1基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1,并将质粒电穿入BCG中,免疫荧光法鉴定其成功.说明成功地构建了胞壁表达Der p2-PEB1融合蛋白重组BCG pCW-Der p2-PEB1-rBCG.为基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

与肺癌侵袭转移相关的miR-424-5p靶基因的预测及鉴定

为研究miR-424-5p参与肺癌侵袭转移的分子机制,筛选与肺癌侵袭转移相关的miR-424-5p靶基因,采用文献调研分析miR-424-5p与肺癌侵袭转移相关的靶基因,并用生物信息学方法筛选miR-424-5p与靶基因3′UTR结合分数较高的靶基因;结合二者的交集筛选出部分靶基因,构建含靶分子3′UTR的荧光素酶报告基因质粒;分别将miR-424-5p模拟物(mimic)与含有靶分子3′UTR的荧光素酶报告基因质粒共转染293T细胞,进行荧光素酶报告基因实验鉴定靶基因。生物信息学分析表明,与肺癌侵袭转移信号通路相关的基因之一是细胞因子信号传导抑制子5(Suppressor of cytokine signaling 5,SOCS5)。在miR-424-5p mimic或阴性对照(negative control,NC)与野生型靶分子SOCS5 3′UTR双荧光素酶报告基因载体共转入293T细胞后,荧光素酶活性值降低至NC组的46%(P0.01)。而miR-424-5p mimic与靶分子3′UTR突变型报告基因载体共转后,荧光素酶的活性与对照组相比几乎无改变。表明SOCS5可能是miR-424-5p的肺癌侵袭转移相关的一个靶分子。     

大肠杆菌F107菌毛A亚单位基因的克隆与鉴定

用PCR技术，从水肿病大肠杆菌临床分离株中扩增出F107A亚单位基因（fedA)的510bp的全序列。将该PCR扩增产物在BamHⅠ和EcoR Ⅰ位点克隆进pUC18质粒载体，并转化大肠杆菌TG1，再根据限制性内切酶酶切分析筛选出含有fedA的重组质粒pf107G。将重组质粒进行序列测定，结果表明，此重组质粒中的插入序列与发表的fedA是一致的，证明该重组质粒就是含有fedA基因的重组质粒。     

NT3的酵母双杂交诱饵载体的构建和初步鉴定

构建和转化神经营养素3(neurotrophin 3,NT3)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究NT3的功能及作用机制奠定基础。用PCR扩增NT3基因cDNA中编码完整开放读框的基因片段;将该基因片段与pLexA载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op LacZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA NT3重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的二种EGY48[p8op LacZ]酵母都能在SD Gal Raf His Ura培养基中长成白色菌落(同时,转化pLexA pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落),但都不能在SD His Leu Ura培养基中生长,在SD His Ura液中培养16h后,OD600均值均为0.8±0.1。这表明,重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,也没有酵母毒性作用。因此,构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。     

抗HTNV单抗1A8鼠/人嵌合Fab抗体植物表达载体的构建

利用PCR方法,从含有1A8VLCκ基因或1A8Fd基因的重组质粒中扩增出1A8VLCκ基因及1A8Fd基因,并使基因两端携带合适的限制性酶切位点,将其克隆入植物表达载体pCAMBIA2301或pBIl21,构建1A8VLKCκ-pCAMBIA2301和1A8Fd-pBI121。用PCR方法改造酶切位点,继而将含有1A8Fd基因的植物表达框克隆入1A8VLCκ-pCAMBIA2301,构建获得1A8Fab-pCAMBIA2301重组质粒,并导入农杆菌GV3101。为进一步在植物中表达该抗体片段奠定了基础。     

单核细胞增生性李斯特菌srtA基因的克隆与原核表达

为了探究从新疆发病绵羊中临床分离的单核细胞增多性李斯特菌(简称LM90SB2)srt A基因的特异性及其在原核表达质粒p ET32a中的表达,本研究利用PCR技术扩增LM90SB2的srt A基因,测序后并进行序列比对分析,将其克隆到原核表达质粒p ET32a中构成重组表达质粒p ET32a-srt A。重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导使其表达,SDS-PAGE电泳检测,同时采用Western-blotting对表达产物进行了鉴定。结果表明:Srt A蛋白在BL21(DE3)中大量表达,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测分析其为1个分子量为47 ku的融合蛋白,与预期的大小相符合,成功的构建了重组质粒p ET32a-srt A,并使其在BL21(DE3)中获得了高效的表达。本研究为下一步研究其对李斯特菌致病性的影响及制备单克隆抗体奠定了基础。     

The p66shc adaptor protein controls oxidative stress response and life span in mammals

Gene mutations in invertebrates have been identified that extend life span and enhance resistance to environmental stresses such as ultraviolet light or reactive oxygen species. In mammals, the mechanisms that regulate stress response are poorly understood and no genes are known to increase individual life span. Here we report that targeted mutation of the mouse p66shc gene induces stress resistance and prolongs life span. p66shc is a splice variant of p52shc/p46shc (ref. 2), a cytoplasmic signal transducer involved in the transmission of mitogenic signals from activated receptors to Ras. We show that: (1) p66shc is serine phosphorylated upon treatment with hydrogen peroxide (H2O2) or irradiation with ultraviolet light; (2) ablation of p66shc enhances cellular resistance to apoptosis induced by H2O2 or ultraviolet light; (3) a serine-phosphorylation defective mutant of p66shc cannot restore the normal stress response in p66shc-/- cells; (4) the p53 and p21 stress response is impaired in p66shc-/- cells; (5) p66shc-/- mice have increased resistance to paraquat and a 30% increase in life span. We propose that p66shc is part of a signal transduction pathway that regulates stress apoptotic responses and life span in mammals.     

人MiTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

人MiTERF3基因编码线粒体基因转录和能量代谢的负调控因子。采用PCR技术对人MiTERF3基因5''侧翼上游1251 bp启动子序列进行扩增,并将其克隆至荧光素酶表达载体pGL6-TA,构建人MiTERF3基因启动子荧光素酶报告基因质粒。经酶切、测序鉴定后,将其用脂质体转染体外培养的HEK293细胞株,利用双荧光素酶测定系统检测其表达活性。研究结果表明,克隆获得的1251 bp DNA序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。含人MiTERF3基因启动子的报告基因荧光素酶的表达活性显著提高（P<0.05）,约为对照组（空载体pGL6-TA）的9.8倍。本研究通过对人MiTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶表达载体构建与表达活性的测定,为进一步阐明人MiTERF3基因表达的调控机制奠定实验基础。     

P38α对人血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响

目的:研究P38α对人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响.方法:利用硝酸还原酶法检测不同浓度氯化钴作用下人脐静脉血管内皮细胞-12(HUVEC-12)上清中的一氧化氮(NO)的含量.以pRL-TK为内参照,将已经构建好的pGL2-eNOS-p质粒分别与pGL3-BASIC、pcDNA3、p38a、及p38a(AF)共转染HUVEC-12细胞,利用双荧光素酶报告基因技术检测eNOS基因启动子转录活性,并在共转染的基础上加氯化钴刺激,并检测eNOS基因启动子转录活性.结果:氯化钴刺激下HUVEC-12细胞培养上清的NO含量随氯化钴作用浓度增加而提高,成功建立化学缺氧模型;p38a在正常和缺氧条件下均明显降低eNOS基因启动子的活性,可被无活性诱变体p38a(AF)逆转.结论:P38et下调人血eNOS基因启动子转录活性.     

hPNAS-4腺病毒载体的构建及其体外抗肿瘤作用

[摘要] 目的：构建携带人的凋亡相关新基因PNAS-4(hPNAS-4)的重组腺病毒,并观察其感染人肺癌A549细胞所引起的hPNAS-4过表达对体外肿瘤细胞凋亡的影响。方法：用RT-PCR从293A细胞中克隆hPNAS-4编码区cDNA,将其酶切后连接至pENTR11载体上,再通过pENTR11与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST之间的同源重组作用将hPNAS-4基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后经293细胞的包装扩增后得到携带hPNAS-4基因的重组腺病毒;将重组腺病毒体外感染人肺癌A549细胞;用RT-PCR检测感染细胞中hPNAS-4的过表达情况;通过MTT、流式细胞术及DNA Ladder分别检测感染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从293A细胞中中克隆到hPNAS-4全长cDNA并成功构建腺病毒表达载体Ad-hPNAS-4,经测定其滴度为：2.4×108 pfu/ml,感染人肺癌A549细胞后：经RT-PCR测得其mRNA表达明显上调,MTT检测结果为细胞增殖受到明显抑制,流式细胞术测得细胞凋亡率明显升高,琼脂糖凝胶电泳显示其基因组DNA有明显的梯状条带（DNA ladder）;结论：hPNAS-4腺病毒载体感染人肺癌A549细胞后,发现hPNAS-4过表达对肿瘤细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用,为今后研究其分子机制以及hPNAS-4腺病毒载体应用于肿瘤动物实验和肿瘤基因治疗提供实验资料。     

流感病毒H3N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达

目的克隆、表达和鉴定流感病毒H3N2血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆流感病毒H3N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA(52 bp～1 549 bp)、pMET A/NA(121 bp～1 260 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了流感病毒H3N2 HA、NA基因序列,为流感病毒H3N2诊断试剂和疫苗开发等进一步研究奠定了基础。     

SLC38A3抗体的制备及细胞内定位

从人胎肝cDNA文库中钓取得到SLC38A3全长cDNA序列.利用生物信息学方法对SLC38A3蛋白序列进行分析,根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择一段多肽序列作为抗原用于抗体制备.将该片段克隆到pET-DsbA融合蛋白表达载体上,在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下产生SLC38A3抗原肽.纯化目的蛋白并制备兔抗SLC38A3蛋白的多克隆抗体.利用Western blot鉴定抗体特异性,并初步分析该蛋白在人肺癌细胞A549内的定位.结果显示,成功构建了SLC38A3片段的原核表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,制备了特异性较高的人SLC38A3蛋白多克隆抗体,并证实该蛋白表达于细胞质内.为进一步研究SLC38A3的生物学功能奠定了基础.     

A型口蹄疫病毒VP1免疫活性肽基因串联片段的化学合成及克隆与表达

A型口蹄疫病毒（FMDV）VP1蛋白的141～160和200～213位氨基酸序列是决定FMDV免疫原性的抗原决定簇片断．人工合成一个免疫活性肽基因的串连片段（20AA－14AA-20AA）、全部选用大肠杆菌偏爱密码子．在5’端带有EcoR1位点和一个起始密码子ATG，在3’端带有BamH1位点和一个终止密码子TGA．利用这两个酶切位点把该基因连接到pWR590质粒上．并筛选高表达的菌株．结果表明该融合蛋白在大肠杆菌JM101中能高表达．经斑点ELISA实验证明．大肠杆菌细胞中表达的融合蛋白有A型FMDV抗原活性．     

人WDR79基因启动子表达载体的构建及鉴定

人WDR79是一种重要的支架蛋白,在端粒酶组装、卡哈尔体(Cahar body)形成和DNA损伤修复等过程中发挥着重要作用。采用PCR扩增技术获得人WDR79基因启动子上游DNA序列,构建人WDR79基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-WDR79-promoter;通过双酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA测序和荧光素酶活性测定等实验手段,验证质粒pGL3-WDR79-promoter构建的正确性及其表达活性。本研究结果为进一步探讨人WDR79基因表达的调控机制奠定实验基础。     

建立利用萤光素酶快速检测细胞活性的方法

运用PCR的方法,从萤火虫萤光素酶基因载体 pGL4.26 扩增萤火虫萤光素酶基因片段,将其插入连接于原核表达载体pET24a 中,构建重组表达载体pET24a-Luc.经酶切鉴定及序列分析后,将重组载体转化到表达菌株大肠杆菌BL21（DE3） 中,获得阳性重组菌BL21/pET24a-Luc.IPTG诱导蛋白高效表达并通过镍柱亲和层析纯化萤火虫萤光素酶.该目的蛋白活性用Bright-GloTM试剂进行验证并用于建立一种基于测量ATP含量的检测细胞生物活性的方法.与传统的细胞生物活性检测试剂盒MTT,CCK-8以及Alamar Blue比较,该方法具有反应迅速、活力高、灵敏度好、生产方便的优点,具有实际应用的潜力.