金色链霉菌原生质体的制备

对金色链霉菌原生质体制备的具体条件进行了优化研究 .发酵培养基中采用蔗糖浓度 12 %、甘氨酸浓度 0 .5 %、酶解条件采用菌龄为 48h的菌丝、溶菌酶浓度 6mg/mL、酶解时间为 1h制备原生质体 ,原生质体制备率可高达 6 0 %以上 .     

链霉菌702原生质体的制备和再生条件研究

为了确定链霉菌702菌株原生质体制备和再生较优组合条件,以链霉菌702菌株为试验材料,试验设计以单因素和多因素多水平的正交试验。在单因素试验结果中探索该菌的对数生长期为35 h~50 h,在菌丝体培养基中添加1.0%甘氨酸有利于该菌原生质体制备和再生;正交试验分别以影响该菌原生质体制备和再生的菌丝体培养时间、溶菌酶使用浓度、酶解温度和酶解时间的四因素三水平的L9(34)正交试验,试验表明:链霉菌702菌株原生质制备和再生较优组合为A2B2C3D1,即菌丝体培养时间为43 h,溶菌酶浓度为2.0 mg/mL,酶解温度为37℃,酶解时间60 m in,原生质体的制备率和再生率分别达到96.5%和27.8%。本试验为该菌进一步进行原生质体诱变打下良好的基础。     

刺孢吸水链霉菌与淡紫灰链霉菌原生质体制备条件研究

通过对甘氨酸浓度、酶解温度、酶浓度、酶解时间等影响因素考察,及正交试验优化,确定了刺孢吸水链霉菌和淡紫灰链霉菌原生质体制备的最佳条件.实验结果表明,刺孢吸水链霉菌最佳原生质体制备条件是：甘氨酸浓度为0.5%,酶解温度28 ℃,溶菌酶浓度为3×10-3 g/mL,酶作用时间60 min;淡紫灰链霉菌：甘氨酸浓度为1.0%,酶解温度32 ℃,溶菌酶浓度4×10-3 g/mL,酶作用时间60min.有效的原生质体保存条件是：-20 ℃,在5 d内,原生质体再生率在15%以上.     

产色链霉菌SY20-2与龟裂链霉菌SY20-4的种间原生质体融合

利用卡那霉素(250μg/mL)、链霉素(1 000μg/mL)和罗红霉素(150μg/mL)标记亲本菌株SY20-2、SY20-4,进行种间原生质体融合.试验结果表明,培养基中加入0.5%~1%甘氨酸可以提高菌丝体对溶菌酶的敏感度,有利于原生质体的释放.溶菌酶不仅影响原生质体的形成,而且影响原生质体的再生率,因此在35℃水浴条件下,SY20-2选择酶浓度2 mg/mL,作用时间30 min;SY20-4选择酶浓度4 mg/mL,作用时间40 min,最适于原生质体的再生.以45%PEG(分子量1 000)作助融剂,融合频率为0.124%,选出153个融合子,其中3株重组子的稳定性及抑菌活性较好,重组子C对烟草野火病菌的抑菌活性比对照要好.     

谷氨酸产生菌原生质体的制备和再生

6株谷氨酸产生菌以甘氨酸、青霉素和溶菌酶不同组合处理,对其原生质体形成进行了比较,在最佳条件下,原生质体形成率可达95～100％。B9-15 菌株细胞形态特殊,表面呈凹陷状,仅在含1.5～2.0％甘氨酸的高渗培养液中就能形成原生质体,在加有壁制剂的丁二酸钠高渗培养基上,所试菌株的原生质体再生率从10.5％～61.8％,差异性较大。     

林肯链霉菌原生质体形成、再生和融合的研究

林肯链霉菌生长在0.5%甘氨酸的S培养基中,能较好地被溶菌酶破壁形成原生质体。原生质体能在RB培养基上再生,但不能在R_2培养基上再生,这和已报道过的其他链霉菌不同。78-11菌株的再生频率约为25.7%,S-3菌株的再生频率约为20.5%。PEG(聚乙二醇)1000对诱导融合的效果较好,重组频率最高可达10~(-2)。重组子和亲本在培养特性、孢子形态方面无特殊差异,但经C_O~(60)诱变后重组子的正变率超过亲本。     

产辅酶Q10的类球红细菌原生质体制备和再生研究

 辅酶Q₁₀(CoQ₁₀)是人类细胞自身产生的内源性辅酶因子,是一类天然抗氧化剂,目前已广泛应用于医药、食品、化妆品等诸多领域.基因组改组技术的核心内容为原生质体融合,为了提高基因组改组的效率,提高辅酶Q₁₀的产量,本研究对产辅酶Q₁₀的类球红细菌原生质体制备及再生条件进行了优化,通过生长曲线、正交试验等确定了原生质体制备及再生的适宜条件：溶菌酶浓度1mg/mL、作用温度37℃、作用时间1h以及再生培养基蔗糖浓度10%.在此条件下,类球红细菌原生质体形成率可达到96.1%,再生率可达到28.8%.这为进一步对该菌的基因组改组研究奠定了基础.     

米曲霉F16原生质体的制备和再生研究

目的:研究菌龄、酶液组成、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂、培养基成分等因素对米曲霉F16原生质体制备和再生的影响。结果表明,米曲霉原生质体制备和再生的最佳条件是:菌龄15h,酶液为0.75%纤维素酶、0.75%蜗牛酶、0.5%溶菌酶的混合酶液,酶解时间2.5h,温度为28℃,最适原生质体再生培养基为含有0.6mol/LNaCl的PDA培养基。     

鰤鱼诺卡氏菌与黄粉色诺卡氏菌原生质体融合的研究

鰤鱼诺卡氏菌是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,黄粉色诺卡氏菌为一种近缘无毒环境诺卡氏菌.本实验研究主要以鰤鱼诺卡氏菌和黄粉色诺卡氏菌为两亲本,开展了原生质体融合研究.针对诺卡氏菌细胞壁厚的特性,本实验对原生质体制备时的溶菌酶脱壁时间进行了筛选,确定鰤鱼诺卡氏菌和黄粉色诺卡氏菌的最佳脱壁时间分别是65 min和100 min.用聚乙二醇促使两亲本菌的原生质体融合后,通过选择性培养基培养、菌落形态筛选、革兰氏染色观察、16S rRNA测序等方法,对融合菌株进行了初步鉴定.鉴定结果表明:融合菌株的菌落形态较两亲本发生了改变,为革兰氏阳性菌,通过16S rRNA基因序列比对,其与鰤鱼诺卡氏菌的同源性为99%.融合菌株的毒力较鰤鱼诺卡氏菌野生株有所降低.本研究为鰤鱼诺卡氏菌活疫苗的研制提供了新思路,对鱼类诺卡氏菌病的防治具有一定的潜在价值.     

光合细菌种间原生质体融合及融合子鉴定

以浓度为3mg/l的溶菌酶溶液处理对数生长期的光合细菌球形红假单胞菌(丙酸钠~-)和沼泽红假单胞菌(甘露糖醇~-)50min,获得两菌体形成的原生质体,再生率分别为86％和62％。等量的两亲株原生质体在35％聚乙二醇(PEG,MW.6000)诱导下融合5min,融合率为2.1×10~(-4)。经影印法鉴定,生成的融合子可以分别在丙酸钠和甘露糖醇为唯一碳源的培养基上生长。融合子的体积为3.63um~3,约为两亲株的体积之和。融合子菌落形态特征界于两亲株之间,其降解底物中有机物COD_(cr)的能力,优于任一亲本菌株。获得的融合子杂种细胞,存在着高效降解利用机污染物的优势。     

黑暗链霉菌与卡那链霉菌原生质体融合研究

进行了黑暗链霉菌与卡那链霉菌原生质体融合实验 .结果表明 ,将孢子悬浮液接种于种子培养基 ,然后转移到含 0 .5 %Gly的菌丝体培养基收获的菌丝体对形成原生质体最有利 .分别采用 10mg mL、6 0min及 5mg mL、75min的溶菌酶浓度与酶解时间制备黑暗链霉菌与卡那链霉菌原生质体能达到较高的形成率和再生率 .采用单亲灭活卡那链霉菌原生质体的种间融合法 ,得到与亲株形态明显不同的杂合体菌落 ,并筛选到44株妥布霉素产率提高的菌株 ,幅度最高达到 39% .     

Aspergillus oryzae与Aspergillus niger原生质体的制备、再生与非对称灭活工艺研究

为提高菌丝原生质体的释放量和活力,分别考查了培养基碳源、菌龄、酶浓度、酶解时间及再生培养基种类对Aspergillus oryzae和Aspergillus niger 原生质体释放和再生的影响,并研究了两亲本原生质体的非对称灭活参数。结果表明:（1）以MPY液体培养基为菌丝培养基,按105个孢子/ml培养基的接种量接入新鲜孢子悬液,30 ℃/100 rpm分别振荡培养18和21 h,总浓度15 mg/ml的复合酶液（溶壁酶：蜗牛酶：纤维素酶＝1:1:1）按1 g湿菌丝球/10 mL酶液的比例,于30 ℃/70 rpm条件下酶解2.5 h,然后以高渗豆汁固体培养基为再生培养基,在上述制备工艺参数下两亲本原生质体的释放量和再生率均可达到107个/ml和30％以上;（2）通过灭活曲线确定A. oryzae HN3042原生质体于15 W紫光灯垂直距离13 cm处照射15 min,A. niger CICC2377原生质体于65 ℃水浴10 min,此灭活剂量可使99％以上双亲原生质体非对称失活。     

糙皮侧耳831原生质体的分离和再生

本试验利用蜗牛酶和溶壁酶处理糙皮侧耳幼嫩菌丝,成功地分离出原生质体,原生质体数量为6.0×10~5～1.07×10~7个/ml;再生频率为1.38%,再生菌株出菇正常,生物学效率多在100%以上。     

猴头菌原生质体制备条件的研究

比较了不同酶液、酸碱度，渗透压稳定剂，菌龄和菌丝培养基成分等因素对猴头菌菌丝释放原生质体作用的影响。结果表明：在土豆培养基（ＰＤＰ）上静止浅层培养９６小时的菌丝，用２％的溶壁酶液，以０．６ｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ４为渗透压稳定剂，在ＰＨ５．５的条件下酶解，获得的原生质体数最大。     

金针菇菌丝体静置培养的研究

在碳源为２％,氮源含量为０．１％,采用液本静置培养方法,研究了金针菇Ｆq-19菌株对碳源、氮源、矿质元素和生长因子的利用。试验表明,金针菇Fq-19菌丝营养对有机氮的利用比对无机氮强,有机氮中,其对复合氮素如酵母粉、蛋白胨、黄豆粉的比单一氮素如尿素、谷胺酰胺强,在无机氮中,其对铵态氮的利用较强硝态氨基本上不被利用。金针菇Ｆq-19菌株对碳素营养的利用较很广泛,在多糖中,对玉米粉的利用最好。其次是可溶性淀粉,对纤维素的利用较差;单糖 的葡萄糖,双糖中的红糖、白糖、蔗糖、麦芽糖是理想的碳源,在缺碳素营养、氮素营养的培养基上菌丝不生长。添加生长因子可促进菌丝的生长,以葡萄为碳源,硫酸铵为氮源,金针菇Ｆq－１９菌株适宜Ｃ／Ｎ为１７－２４：１,最适宜Ｃ／Ｎ为２０：１。当Ｃ／Ｎ比为２０：１时,菌丝生长旺盛,对营养利用较为合理。除碳、氮源外,维生素Ｂ１,Ｋ,Ｐ,Ｍ是金针菇菌丝生长的必须因子。     

新西兰青霉(Penicillium novae-zeelandiae)原生质体的制备与再生研究

利用酶对新西兰青霉菌的菌丝进行酶解获得原生质体,探究了影响原生质体制备和再生的因素,包括酶种类,酶浓度,菌丝培养时间,酶解时间和温度,pH,二硫苏糖醇(DTT)预处理等.结果显示最佳酶解条件为:菌丝体培养48h,用0.05mol·L~(-1) DTT预处理0.5h,以0.8mol·L~(-1)氯化钠作为稳定剂,31℃条件下经Lywallzyme(10mg·mL~(-1))酶解4h,原生质体数量达到4.75×107 g~(-1),再生率为18.0%.     

富硒鸡腿菇菌丝体深层发酵培养基的优化

研究营养因子对鸡腿菇菌丝体生长和富硒的影响,筛选到适合鸡腿菇富硒深层发酵的优化培养基配方为:葡萄糖2%,玉米粉4%,花生粕0.4%,KH2PO4 0.2%,MgSO4·7H2O0.1%,VB1 10×10-3 g/L,Na2SeO3 4.4×10-3 g/L.在此优化培养基的基础上进行5 d的摇瓶发酵培养,得到菌丝体生物量为18.14 g/L,富硒率为56.35%.     

平菇原生质体制备、再生及灭活研究

紫孢侧耳、糙皮侧耳和佛罗里达侧耳的原生质体制备与再生的最佳条件为：用１％溶壁酶＋０．５％蜗牛酶的混合酶液酶解培养３～４天的菌丝体，１．５小时后，原生质体产量均可达１０￣（１０）个／Ｌ；三种侧耳的最佳再生培养基分别为ＳＭ、ＭＰ和ＲＰ，再生率分别为０．６１％、０．６７％和０．７６％。随着紫外线对原生质体处理时间的加长，再生率逐渐下降，当处理４ｍｉｎ时，再生率接近零。     

β-寡聚酸对4种食用菌菌丝生长的影响

以杏鲍菇、鸡腿菇、灵芝、猴头4种食用菌为实验材料,分别在PDA和栽培料培养基中加入不同浓度的β-寡聚酸,研究不同浓度的β-寡聚酸对4种食用菌菌丝生长的影响,结果表明：在PDA培养基中,β-寡聚酸浓度为1.0 mL/L时,菌丝生长速度最快,与对照组有显著性差异;在栽培料培养基中,β-寡聚酸质量浓度为2.0 mL/kg时,菌丝生长速度最快,与对照组有显著性差异.可选择β-寡聚酸为1.0 mL/L和2.0 mL/kg分别作为4种食用菌PDA母种培养基和生产中固体栽培料中添加的最适浓度.