抗冻蛋白的研究进展及其在食品工业中的应用

抗冻蛋白是一类具有热滞效应、冰晶形态效应和重结晶抑制效应的蛋白质,因其特殊的结构和功能,抗冻蛋白引起了研究人员的极大兴趣.探讨了近年来抗冻蛋白的研究进展,介绍了目前已知的抗冻蛋白的来源、特性、测定方法、基因结构及在食品工业中的应用.抗冻蛋白对冷冻食品有显著的品质改良功能,是未来冷冻食品工业中极具潜力的抗冻添加剂.     

植物抗冻蛋白的生物化学研究进展

抗冻蛋白是一种能抑制冰晶生长的蛋白质或糖蛋白质．自二十世纪60年代发现以来，研究对象先后从极区鱼类、昆虫转移到植物材料上．抗冻蛋白包括抗冻糖蛋白、抗冻蛋白Ⅰ、抗冻蛋白Ⅱ、抗冻蛋白Ⅲ、抗冻蛋白Ⅳ．简要介绍了植物抗冻蛋白的生化特征、抗冻机制及其应用研究，并对抗冻蛋白的基因工程作了系统综述．     

抗冻蛋白基因定向突变及其抗冻关系的研究

为探讨抗冻蛋白的抗冻机制,根据抗冻活力较高的肝型抗冻蛋白的氨基酸组成,改造皮肤型抗冻蛋白基因,使皮肤型抗冻蛋白基因的10位氨基酸－丙氨酸（A）改造成天冬氨酸（D）,方法：合成一段含有突变位点的DNA片段,用其取代野生型DNA上相对应的片段,DNA测序法筛选阳性克隆并表达该蛋白,Western-blot法、氨基酸组成分析法、及质谱法鉴定表达蛋白,测定突变后抗冻蛋白的的活力并与野生型比较,以期揭示抗冻蛋白的抗冻机制。     

冬蝶鱼皮肤型抗冻蛋白的克隆及表达

冬蝶鱼皮肤型抗冻蛋白（ｗ ｆｓ Ａ Ｆ Ｐ）的克隆和表达,是研究抗冻蛋白抗冻机制的重要步骤之一,有助于揭示抗冻蛋白分子结构与活力的关系．用 Ｐ Ｃ Ｒ 法获得 ｗ ｆｓ Ａ Ｆ Ｐ 基因片段,构建了分泌型表达载体 Ｐｌａｃ Ｉ Ｑｐａｒ８ｗ ｆｓ Ａ Ｆ Ｐ．用 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 法测其表达水平,氨基酸组成分析及质谱分析证明表达的蛋白与天然蛋白完全一致,并具有天然蛋白相同的活力．     

冬鲽鱼抗冻蛋白基因的人工合成

合成适合在棉花中表达的冬鲽鱼抗冻蛋白（Winter flounder antifreeze protein,Wf-AFP）基因.参照冬鲽鱼抗冻蛋白的氨基酸序列及棉花偏爱的密码子,重新设计适合在棉花中表达的Wf-AFP基因序列;根据此序列设计6条寡核苷酸引物,通过PCR方法将其拼接成完整的基因;克隆到pUCm-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,抽提重组子进行酶切鉴定及序列分析.结果表明合成的Wf-AFP基因序列与设计方案完全相符,通过PCR介导的基因合成方法成功获得了适合在棉花中表达的冬鲽鱼抗冻蛋白基因.     

黄粉虫抗冻蛋白基因TmAFP84的克隆和序列分析

对黄粉虫抗冻蛋白(AFPs)基因进行RT-PCR扩增后,构建克隆重组质粒pUCm-T-TmAFP84,经双酶切、PCR和测序鉴定,克隆出了与GenBank中公布的编码84个氨基酸基因(注册号AF159114)基本相一致的抗冻蛋白基因TmAFP84,其同源性高达98.81%.与其他编码84个氨基酸的抗冻蛋白基因的同源性为95.92%.进而构建了表达重组质粒pMAL-p2X-TmAFP84.     

抗冻蛋白基因转化植物的研究展望

重新评估了用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化烟草的研究，认为植物耐寒性状的提高与转基因植物中冻抗蛋白含量呈正相关是转基因植物成功的关键性指标。美洲拟鲽抗冻蛋白的空间结构与冷冻诱导蛋白相似而且都保护细胞膜免受冻害，因而提出了用冷诱导蛋白调节元的顺式作用元件和反式作用因子的调控序列来控制抗冻蛋白基因在植物中冷诱导表达的思路。     

鱼源Ⅲ型抗冻蛋白的生物学活性

为了通过细菌低温保护实验测定鱼源Ⅲ型抗冻蛋白（AFPⅢ）对大肠杆菌的低温保护效果,利用前期构建的原核表达质粒pET32a（＋）-AFPⅢ转化大肠杆菌,目的蛋白以融合his标签的形式在大肠杆菌中表达,经NI柱亲和层析得到较高纯度的AFPⅢ-his融合蛋白。细菌抗冻实验的结果表明,外加一定浓度范围内的纯化的AFPⅢ融合蛋白对细菌有明显保护作用,但是抗冻蛋白的浓度对细菌的保护力不成一致的线性关系。鱼源Ⅲ型抗冻蛋白的浓度在50μg／mL时抗冻效果最好,并且随着温度的下降,抗冻蛋白对细菌的保护能力与Glycerol对细菌的保护能力的差距逐渐减少,在-80℃时基本可以代替甘油用于菌种保存。     

植物冰结构蛋白的功能机制及其应用

冰结构蛋白是具有热滞效应、冰晶形态效应和重结晶抑制效应的蛋白质.介绍了最近的抗冻蛋白的分类,植物冰结构蛋白作用机制,植物冰结构蛋白与其它病程相关性蛋白或酶的同源性,冰结构蛋白与冰晶间的相互作用,热滞效应和抑制重结晶作用,及其在生产中的应用.     

抗冻蛋白诱导冰晶界面层融化的分子动力学模拟

在低温环境中生存的某些生物体内,有可以保护生物体避免冰冻带来伤害的特殊功能的蛋白质,这类蛋白质被称为抗冻蛋白.抗冻蛋白可以非依数性降低冰晶的生长点温度.利用分子动力学模拟的方法,通过计算体系总能量和氢键数目的变化,分析在冰水界面处吸附结合的黄粉虫抗冻蛋白(TmAFP)和鱼类的冬碟(wfAFP)抗冻蛋白对冰晶界面结构的影响.研究结果显示,在冰晶熔点与生长点的温度区间内,吸附到冰晶表面上的黄粉虫抗冻蛋白和冬碟抗冻蛋白,可以影响冰晶界面层的稳定性,使固相水分子向液相水分子转变,诱导冰晶的界面层融化.     

"表面互补"模型--抗冻蛋白通用的分子机理

抗冻蛋白(antifreeze protein,AFPs)是一类能控制冰晶生长和抑制冰晶之间发生重结晶的蛋白质,能在结冰或亚结冰条件下保护生物体不受伤害.AFPs具有两种明显不同的活性--热滞活性和重结晶抑制活性.AFPs虽然在氨基酸序列、物种来源和高级结构等方面具有很大的差异,但都能通过吸附作用与特定的冰晶表面相结合,从而表现出相应的抗冻活性.AFPs与冰晶结合的分子机理主要有"氢键结合"模型和"表面互补"模型,而后者具有更强的优势,已逐渐发展成AFPs通用性的分子机理.目前已测定或建模了三维结构的AFPs都能与冰晶的特定表面形成表面互补,但形成这种表面互补的各种作用力还有待于进一步的研究.     

印楝Azadirachta Indica A.Juss的冷驯化与抗冻蛋白的研究

采用木本植物材料——印楝,通过组织培养建立快繁体系,然后对其进行冷驯化处理,并分析检测印楝植物体内抗冻蛋白.主要结果如下:①冷驯化处理后印楝的总蛋白一些表现为量的增加同时会有新的蛋白产生.但脱驯化或处理时间过长时,抗冻蛋白在量的表达上会有逐渐减少或消失的现象.②在对印楝的冷驯化中,发现不同的温度处理后蛋白稳定存在的时间不同.抗冻蛋白出现的最早时期为5℃处理2周左右,印楝能耐受的稳定最低温为5℃,所持续的最长时间约为20d.在0℃低温处理后,虽然在处理初期(0～15d)也有抗冻蛋白的产生,但随处理时间的延长,这种差异逐渐减少,在处理30d时完全消失.③得到了分离纯化的抗冻蛋白,其相对分子质量约为3.6×104.     

第一类鱼抗冻蛋白分子对冰晶表面平衡结构的影响

根据冰晶生长理论,在一定的生长驱动力作用下,冰晶界面生长机制和动力学规律决定于冰晶界面的微观结构.从大分子溶液热力学性质出发,得到了结合抗冻蛋白后冰晶表面微观平衡结构的变化,并讨论了这种变化对冰晶生长形态的影响.结果显示抗冻蛋白造成冰晶表面微观平衡结构改变,是抗冻蛋白溶液中冰晶生长的形态与纯水中冰晶生长的形态有显著区别的原因之一.     

负温混凝土防冻剂掺量确定方法实验研究

掺入适量的防冻剂可以有效地提高冬期施工混凝土工程的质量,如何合理地确定防冻剂的用量进行了系统地研究。提出了结合施工现场实际环境及条件确定负温混凝土防冻剂掺量的方法,在理论分析和推导的基础上,得到了混凝土达到临界成熟度值时的养护时间t抗及温度T抗,选择混凝土冰点Tb≤T抗的混凝土配合比,即确定出了混凝土防冻剂的掺量。并通过实验验证,实验结果表明:通过这种方法确定的防冻剂掺量,负温混凝土抗折强度和抗压强度分别是标准养护的99%和100%,满足负温施工的要求。     

胡萝卜抗冻蛋白基因的克隆及其在E.coli中的表达

对中国的一个胡萝卜品种进行了冷诱导前后幼苗总蛋白组成的比较、分析 ,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果表明两者在相对分子质量 36 0 0 0附近有一条蛋白带的差别。由此推测实验的胡萝卜品种在冷诱导过程中有抗冻蛋白 (AFP)表达。根据相关的研究结果设计引物 ,以胡萝卜幼苗基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增得到了长 10 99bp的抗冻蛋白基因。测序结果表明其与GenBank公布的afp序列仅有 3个碱基的差别。将此抗冻蛋白基因克隆进大肠杆菌表达载体pGEX4T1,在IPTG的诱导下表达出了含有AFP的约 6 0 0 0 0的融合蛋白 ,证明该AFP基因在原核表达系统中可以正常表达     

极区鱼的抗冷冻机理

鱼抗冷冻蛋白和抗冷冻糖蛋白有抗冻功能，本文阐述并讨论了各种抗冻机理学说。本文在预测了ＡＦＰⅠ、ＡＦＰⅡ和ＡＦＰⅢ的二级结构并分析了ＡＦＰ三级结构的特点基础上，计算了抗冷冻蛋白的热滞，得出了与实验相符结论．     

Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect

Insect antifreeze proteins (AFP) are considerably more active at inhibiting ice crystal growth than AFP from fish or plants. Several insect AFPs, also known as thermal hysteresis proteins, have been cloned and expressed. Their maximum activity is 3-4 times that of fish AFPs and they are 10-100 times more effective at micromolar concentrations. Here we report the solution structure of spruce budworm (Choristoneura fumiferana) AFP and characterize its ice-binding properties. The 9-kDa AFP is a beta-helix with a triangular cross-section and rectangular sides that form stacked parallel beta-sheets; a fold which is distinct from the three known fish AFP structures. The ice-binding side contains 9 of the 14 surface-accessible threonines organized in a regular array of TXT motifs that match the ice lattice on both prism and basal planes. In support of this model, ice crystal morphology and ice-etching experiments are consistent with AFP binding to both of these planes and thus may explain the greater activity of the spruce budworm antifreeze.     

复合防冻剂的防冻机理及施工要求

在建筑工程中,混凝土是使用最广泛的一种材料,混凝土的耐久性受到人们的普遍关注,其中冻害性是影响混凝土耐久性的一个最重要的因素。改善并开发抗冻性能良好的混凝土具有非常重大的经济效益与社会效益。而采用掺复合防冻剂混凝土具有施工简便、节能、节约混凝土冬施费用,提高混凝土冬施质量等优点,它不仅能够降低混凝土中液相冰点,同时还具有促凝、早强和减水作用。