南方红豆杉悬浮培养细胞中糖代谢的波动性及其与紫杉烷合成关系的研究

针对悬浮培养南方红豆杉细胞利用不同浓度的蔗糖进行了研究,通过检测细胞内外的蔗糖,果糖和葡萄糖以及胞内淀粉含量的变化,发现细胞团体系中碳素代谢是以胞内淀粉变化为核心的,蔗糖,葡萄和果糖的消耗和吸收呈现波动性,从而促进使细胞生物量的增国和紫杉烷类化合物的合成,同时研究发现细胞对蔗糖的消耗有一个临界点,即培养液中有1mg/mL的蔗糖不能被吸收,而培养液中浓度为3％的蔗糖对细胞攻产物合成最为有利,蔗糖大部分被降解成葡萄糖和果糖,其中葡萄糖有利于细胞的前期生长以获得大量的生物量,果糖在中期添加有利于细胞培养后期合成紫杉烷类化合物,其中紫杉醇并不是次生代谢途径的最终产物。     

南方红豆杉紫杉烷7β-羟基化酶基因全长序列的克隆和进化分析

 从南方红豆杉Taxus wallichiana var.mairei的新鲜嫩叶中提取基因组DNA作为模板,利用三组特异引物进行PCR扩增,然后克隆测序得到紫杉烷7β-羟基化酶的基因全长。该基因编码区起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,全长1 692 bp;碱基组成为490 A (29.0%),351 C (20.7%),362 G (21.4%)和489 T (28.9%)。将紫杉烷7β-羟基化酶基因全长序列与细胞色素P450基因家族的其它三个成员进行比对,发现它与紫杉烷2α-羟基化酶基因、紫杉烷10β-羟基化酶基因及紫杉烷13α-羟基化酶基因的一致性分别为74%、68%及76%。它们的外显子和内含子的连接区均具保守的GT-AG结构,内含子区的变异性明显高于外显子区。进一步以红豆杉属的13个紫杉烷羟基化酶基因家族成员为对象,利用位点间可变ω(非同义替换率dN和同义替换率dS的比值) 模型对该基因家族的适应性进化进行分析。分支模型、位点模型以及分支－位点模型的分析表明：紫杉烷羟基化酶基因家族的少数分支处于正选择压力下(ω>1),但未检测到正选择位点;而绝大部分位点受强烈的负选择作用(ω<1)。     

诱导促进中国红豆杉细胞培养中紫杉烷的积累

通过甲苯莉酮酸酯（MJA）或二氢甲基苯莉酮酸酯（HMJA）的诱导，有效增强了中国红豆杉（Taxus chinensis）悬浮细胞培养中新型生理活性物质云南紫杉烷（taxuyunnanine C,Tc）的积累。在培养第7天添加500μmol/L MJA后，产物的胞内最大含量为每克干细胞含29.5ng Tc，但细胞生长受到明显抑制；在添加100μmol/LMJA时，Tc的总产量达最大，为300mg/L。紫杉烷生物合成途径中的关键酶紫杉二烯合成酶的活力在被诱导后也获得大幅度提高。     

南方红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离和筛选

从南方红豆杉中分离得到21株内生真菌,在PDA液体培养基中发酵后经HPLC检测,发现有3株能够产生紫杉醇,它们是XT5(Ectostromasp.)、XT2(botrytissp.)和XT17(Papulasporasp.),其紫杉醇产率分别是276.75μg/L、161.24μg/L和10.25μg/L.     

人工栽培南方红豆杉紫杉烷成分的研究

采用溶剂萃取及多种色谱技术分离纯化,从人工栽培南方红豆杉中分离得到紫杉醇(Ⅰ)、2′-乙酰氧基-7-表-紫杉醇(Ⅱ)、(3E,7E)-2,α10,β13α-三乙酰基-5,α20-二羟基-3,8-断紫杉烷-3,7,11-三烯-9-酮(Ⅲ)和7-表-紫杉醇(Ⅳ),其中化合物(Ⅱ)首次从南方红豆杉分离得到。     

红豆杉中紫杉烷类化合物制备10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ

红豆杉是我国珍稀植物,含有多种紫杉烷类化合物．以紫杉醇提取过程中的废料作为原料,首次将含7-木糖基．10-去乙酰基紫杉醇、7-木糖基-10去乙酰基三尖杉宁碱和7-木糖基．10-去乙酰基紫杉醇C三种化合物的混合物通过氧化、水解反应脱去紫杉烷类化合物C-7位上的木糖基,然后进行肼解反应脱去C-13位上的侧链,最后利用重结晶纯化,得到10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)．实验过程中用液质联用(LC/MS/MS)鉴定反应产物,通过核磁共振确认得到10-DABⅢ．结果表明,含10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ母环结构的紫杉烷类化合物——尤其是含木糖基的紫杉烷类化合物是能够转化为10-DABⅢ的．由于10-DABⅢ是半合成紫杉醇的原料,这对于提高紫杉醇的产量,缓解紫杉醇资源短缺的现状有着积极的作用．     

日本东北红豆杉枝化学成分研究

采用甲醇浸泡提取制得浸膏,再将浸膏加饱和食盐水溶解后依次用正己烷萃取除去油脂,再用二氯甲烷萃取浓缩萃取物。用柱层析、重结晶和高效液相色谱等进行分离,得到两种单体化合物,经1H-NMR,13C-NMR和IR鉴定并与文献对照,确定一种为紫杉吉酚,另一种为紫杉平F。     

一株产紫杉醇的红豆杉内生真菌的分离鉴定

用组织研磨涂布法对中国红豆杉中产紫杉醇的内生真菌进行分离,得到45株内生真菌;通过形态学和分子生物学手段对一株产紫杉醇的菌株Tax-4进行鉴定,其结果为黑团壳属(Massaria)。表明从中国红豆杉中分离得到了一株产紫杉醇的黑团壳属内生真菌,丰富了产紫杉醇内生真菌的资源。     

红豆杉抗癌有效成分的研究

利用藏产红豆杉（ Ｔａｘｕｓ Ｗａｌｌｉｃｈｉａｎｓ Ｚｕｃｃ） 的小枝叶,经粉碎,用有机溶剂提取,提取物进行极性溶剂的梯度萃取,色谱柱分离,分段洗脱收集,将各收集部位分别结晶,得两个结晶物。将结晶物经理化检测,光谱分析鉴定,其结构为Ｉ（ＢａｃｃａＴｉｎ） 和Ⅱ（Ｃｅｐｈｉｏｍａｎｉｎｅ） 。经活性实验研究,它们均有较强的抗癌作用。     

红豆杉内生细菌的分离及促生效应

从健康红豆杉根、茎、叶组织中分离出31株内生细菌,对其有益生物学特性进行评价.结果显示:31株菌均能合成植物生长素IAA.其中,HG12,HY23,HY24,HY41具有溶磷特性,有13株菌表现出不同程度的固氮和合成铁体的活性;将HG12,HY23混合培养,发现菌株合成IAA能力下降,其他生物活性则变化不大.经16S r DNA测序分析可知,HG12属于西地西菌属(Cedecea sp.),HY23属于伊查德布丘氏菌属(Buttiauxella izardii).     

南方红豆杉9种无机元素的含量测定分析

用原子吸收分光光度计测定了南工豆杉嫩枝、针叶、树皮中Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｃｒ９种无机元素的含量,发现其Ｚｎ、Ｍｎ含量较高,且树皮中富含Ｋ、Ｆｅ、Ｎａ。     

南方红豆杉种子中发芽抑制物的研究

对南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei(Lemee et I,ev1.)Cheng et L. K.Fu)种子各部分的甲醇浸提液进行了生物测定,并通过GC-MS联用仪鉴定,以探讨种子中萌发抑制物质与休眠的关系.结果表明:南方红豆杉种子中种皮、内种皮和胚乳的浸提液对白菜种子发芽率和幼苗的高生长、根生长均有抑制作用,且随浸提液浓度的增大,抑制作用逐渐增强.同时,从南方红豆杉种子的胚乳和中种皮、内种皮中鉴定出多种有机化合物,并确定了它们的种类和相对含量,其中包括已报道的正庚酸、壬酸、乙酸等发芽抑制物质.表明南方红豆杉种子的中种皮、内种皮和胚乳中均含有抑制种子萌发和幼苗生长的物质.     

南方红豆杉扦插繁殖技术研究

通过对南方红豆杉扦插繁殖技术进行研究。确定出最佳的扦插季节,最佳的扦条年龄和适宜的生根粉ＡＢＴ１,处理浓度,为南方红豆杉大规模繁殖提供基础数据。     

继代时间对南方红豆杉细胞生长和产生紫杉醇的影响

通过激素组合正交实验及继代时间的选择对南方红豆杉细胞增殖培养条件进行了优化研究，结果表明在细胞生长对数期继代比静止期继代细胞增长率提高1．6倍，而紫杉醇产量差异不大，同时在对75个激素处理的筛选实验中证实NAA与6－BA的组合优于，2，4－D与6－BA的组合，其中NAA1mg／L＋6－BA1mg／L的处理可获得最大增长率。     

南方红豆杉蒸腾强度与生态因子的关系

采用“三次称重法”测定南方红豆杉(Taxus chinensis var．mairei(Lemee et level)Cheng et L K Fu)换叶期蒸腾强度日变化、月变化,同步定点定位测定生态因子的变化,运用一元线性回归、多元回归分析蒸腾强度与生态因子的关系。结果表明：蒸腾强度日进程呈现早晚低、中午高的曲线,3月与4月为双峰,5月为单峰,即从3月到5月经历由轻蒸腾午休型到非蒸腾午休型的转变;蒸腾作用受生态因子的综合影响,与光照强度和气温显著正相关,与相对湿度显著负相关,其中光照强度影响最大,其次是气温和湿度;不同月份的蒸腾强度差异达到显著水平,引起这种差异的主导生态因子是气温。     

两种红豆杉植物的愈伤组织培养及褐化抑制

在DPS系统均匀设计的基础上,对曼地亚红豆杉(Taxus m edia)和南方红豆杉(Taxus chinensisvar.mairei)的茎和叶进行愈伤组织培养,并探讨愈伤组织褐化的抑制.结果表明:两种植物茎形成愈伤组织能力均强于叶;同一种红豆杉植物愈伤组织诱导率与其直径存在一元线性回归关系;B5培养基添加0.3 mg/L 6-BA和2.9mg/L NAA(曼地亚红豆杉)、0.1 mg/L 6-BA和1.7 mg/L NAA(南方红豆杉)为最适合愈伤组织诱导和生长的培养基;南方红豆杉茎和叶产生愈伤组织平均时间分别少于曼地亚红豆杉茎和叶,其茎和叶愈伤组织平均直径显著大于曼地亚红豆杉;培养基添加0.01~0.2 mg/L抗坏血酸(Vc)能较为有效抑制愈伤组织褐化.