非特异性PCR产物的分离和扩增

在PCR（polymerase chain reaction)扩增产物的非特异性电泳带位置上及弥散状背景的一定间隔位置上，分别以切胶分离相应分子量的DNA分子作为模板，用产生这些非特异性DNA分子的一种引物在通用PCR条件下进行PCR扩增，仅在切胶的相应位置出现DNA分子量同样大小的电泳条带。阐述了这种模板DNA分子形成和出现非特异性电泳带与弥散状背景之间的关系。     

PCR技术在动植物检疫中的应用

一、PCR技术基本原理多聚酶链式反应,英文缩写为PCR,又称无细胞分子克隆法,是近年发展起来的一种快速的特定DNA片段体外扩增法,即一种特异性DNA序列的体外酶促合成方法.PCR利用两个寡聚核苷酸杂交对应链目的区域的侧翼上,一连串反应包括模板变性作用、引物退火和由DNA聚合酶酶促退火、引物延伸的周期性重复产生特定片段的指数积聚.该片段的末端由引物的5′末端决定.因为一个周期所合成的引物延伸产物可作为下一个周期的模板,所以靶DNA拷贝数目在每个周期中近似地呈倍数增加.这样,20个PCR周期可得约百万(2~(20))倍扩增.把扩增产物放进电泳,经溴化乙锭染色后,在紫外灯照射下,肉眼能看见扩增特异区段的DNA带.     

半随机单引物PCR扩增产物的特异性研究

以Ｍ１３ｍｐ１９为模板,寡核苷酸“１２２４”为引物,进行半随机单引物ＰＣＲ扩增;分析其扩增产物的限制性内切酶酶切图谱,推定它们分别在Ｍ１３ｍｐ１９序列中的确切位置;证实引物“１２２４”的３端与模板Ｍ１３ｍｐ１９负链的互补结合,至少需有连续的４上个核苷酸,才能产生单引物ＰＣＲ扩增的模板分子,进行有效的ＰＣＲ扩增,并由此决定了扩增产物中各ＤＮＡ片段的大小及其在模板ＤＮＡ序列中的特定位置。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆及其序列分析

从病变鸡法氏囊组织中分离纯化IBDV,提取其基因组RNA.以IBDVRNA为模板,进行反转录反应合成cDNA第1链.采用PCR技术扩增VP5基因.将PCR产物经酶切后与pcDNA3.1(+)载体连接,经转化、筛选得到重组质粒pIBDV-VP5.对VP5基因进行了测序并对其序列进行了分析.     

甘薯羽状斑驳病毒中国分离株外壳蛋白基因的克隆和序列分析

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV)外壳蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,以我们从国内甘薯品种徐薯-18上分离到的SPFMV的RNA为模板,经过反转录合成cDNA第一条链,经PCR扩增、限制性酶切后克隆于pUC19的Hind 和SacI位点,转化大肠杆菌JM109,经限制性酶切分析、PCR鉴定以及序列分析证实获得了SPFMV中国分离株外壳蛋白基因的全长克隆.     

长片断引物反向PCR方法构建重复序列的重组质粒

构建重复序列的重组质粒比较困难,因为扩增重复序列会产生多聚物.利用长片断引物反向PCR方法构建重组质粒pET20b-C1-Xyn-C1,将碳水化合物结合模块C1连接在木聚糖酶Xyn两端,为类似质粒的构建提供新方法.第一步,以C1特异性正向引物LF、载体特异性反向引物VRP从pET20b-Xyn-C1模板上扩增C1-pET20b长片断DNA,作为第二步的正向引物;第二步,以pET20b-C1-Xyn为模板,Xyn特异性反向引物RX,正向引物与模板上pET20b同源区域匹配,阻止了模板上C1同源区域的匹配,从而抑制多聚物产生;反向PCR扩增得到线性重组质粒C1-pET20b-C1-Xyn,将此线性产物用T4 DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞,得到含重复序列的pET20bC1-Xyn-C1转化子.     

Taq酶体外合成DNA时模板错位机制的探讨

利用Taq DNA聚合酶体外合成DNA过程中,当反应体系中缺少与模板链互补配对的dNTP底物时,产物合成并不会在底物缺失位点处终止,聚合反应继续进行.为研究此复制缺陷现象,设计一系列模板用于DNA体外酶促合成.除了已知的碱基错配机制,笔者发现存在另一种"模板错位"机制,即模板中与底物非Watson-Crick互补配对的碱基位点首先进行收缩滑动,形成模板bulge结构后再继续进行酶促合成反应.这项研究有助于提高DNA样品合成保真度以及继续深入探索体外DNA合成的详细机制.     

构建重组质粒的二步PCR方法

建立一种简单的重组质粒构建方法——二步PCR,不需要限制性内切酶对基因和载体进行酶切.第一步常规PCR中,用正向引物(IF)和反向杂合引物(IR)扩增黑曲霉木聚糖酶Xyn基因,IF与基因特异性匹配,IR引物3’端与基因序列匹配、5’端含有19 bp p ET20b一端正链序列;第二步反向PCR中,以扩增的Xyn基因作为正向引物,其3’端含有19 bp与环状p ET20b模板退火、并在高保真Q5 DNA聚合酶作用下延伸,与模板另一端互补的反向引物VR协同作用,重组质粒通过PCR扩增出来.反向PCR产物经T4 DNA连接酶环化,并经Dpn I限制性内切酶消解处理,可以直接转化BL21(DE3)感受态细胞.用这种方法将622、639、1125、1209 bp大小的基因重组p ET20b中,显示出有较广泛的普适性.     

"突触引物"实时荧光PCR检测端粒酶活性

为建立一种简便的端粒酶测定方法，首先采用高灵敏的核酸染料SYBR Gold染色代替放射自显影，建立了简便可靠的扩增产物显示方法，进而合成了端粒酶扩增产物的模拟产物，考察了突触引物检测的可行性和灵敏度。在此基础上，建立了检测端粒酶活性实时荧光PCR。由于突触引物可以有效的降低非特异性扩增，有效解决了端粒酶活性检测中的非特异产物干扰，为定量检测端粒酶活性打下了基础。