猪繁殖和呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆与序列分析

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）已发表的核苷酸序列,设计了1对特异性引物P1／P2,用RT-PCR扩增了PRRSV福建毒株FJ-1和FJ-2的全长核衣壳蛋白基因（ORF7）,将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,提取阳性重组质粒进行序列测定与分析．结果表明：FJ-1和FJ-2毒株ORF7基因均为372bp,编码123个氨基酸,与美洲型参考毒株VR-2332及欧洲型参考毒株LV的核苷酸同源性分别为95．16％,94．35％和61．40％,60．65％,其推导的氨基酸同源性分别为95．93％,95．12％和56．49％,55．73％．研究表明,福建流行的FJ-1和FJ-2属于美洲型PRRSV毒株．     

PRRSV福建流行毒株结构蛋白基因之克隆分析

对福建省流行的PRRS病毒FJ-1的结构蛋白基因进行了克隆、测序.FJ-1结构蛋白基因序列长3 188个核苷酸,包含7个开放阅读框(ORF).将FJ-1结构蛋白基因与国内外已发表的18个报道全长结构蛋白基因的PRRSV毒株进行核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较,发现:其与17个美洲型毒株核苷酸同源性达到89.7%～92.4%,推定各个ORF编码氨基酸的同源性在85.6%～98.6%之间;而与欧洲型毒株Lelystad核苷酸同源性为54.9%,推定各个ORF编码氨基酸同源性为53.2%～78.2%.遗传进化树分析表明FJ-1与美洲型毒株进化距离近,而与欧洲型毒株进化距离远.从分子水平上证明了福建省流行的PRRS病毒属于美洲型毒株.     

猪繁殖和呼吸综合征病毒福建毒株ORF5的序列分析及原核表达

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(p1/p2),用RT-PCR扩增PRRSV福建毒株FJ-1的全长糖基化囊膜蛋白基因(ORF5),将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,筛选阳性重组质粒进行序列测定与分析.再设计另一条引物(p3)与p2从重组载体pUCm-T-ORF5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入表达载体pGEX-4T-3后在大肠杆菌中表达.结果表明,FJ-1毒株ORF5基因为603 bp,编码200个氨基酸,与北美型参考毒株VR-2332、CH-1a及欧洲型参考毒株LV的氨基酸同源性分别为87%、89%和53%,推定福建毒株FJ-1属于北美型毒株.原核表达产物经过SDS-PAGE及Western Blot分析,证实为GP5与谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白.分子量为41 kDa.表达量约占菌体蛋白的15%,主要以包涵体形式存在.     

羊口疮病毒新疆野毒株SHZ1 B2L和F1L基因的克隆及遗传进化分析

为了研究羊口疮病毒(ORFv)新疆野毒株的遗传进化情况,参照GenBank公布的ORFv B2L和F1L基因序列,设计特异性引物,对ORFv SHZ1新疆野毒株B2L和F1L基因进行PCR扩增,克隆、测序后进行遗传进化分析。结果表明:新疆野毒株SHZ1与GenBank公布的不同地域的17个流行株相比,B2L基因核苷酸同源性为97.28%～98.86%,推导氨基酸同源性为88.65%～90.50%;F1L基因核苷酸同源性为94.56%～97.07%,推导氨基酸同源性为93.82%～95.88%。基于B2L基因的遗传进化树分析发现,SHZ1株B2L基因与我国现用疫苗株B2L基因亲缘关系较近;而基于F1L基因的遗传进化树显示,SHZ1株与意大利分离株的亲缘关系最近。本研究提示ORFv SHZ1株可能是国外流行株与疫苗株重组后产生的一个变异株。     

猪生殖-呼吸道综合征病毒CH-1a株结构蛋白基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR方法克隆了我国首次分离的PRRS病毒CH-1a株的6种结构蛋白基因(ORF2～7),并进行了核苷酸序列测定．利用序列分析软件分析了各基因编码产物的分子量、等电点、疏水性、抗原性和糖基化位点等,并与欧美毒株进行了比较,绘制了其系统发育进化树．结果显示cH-1a株与流行于北美洲的PRRS病毒株遗传关系很近,而与欧洲的病毒株遗传关系较远,表明流行于我国的PRRS病毒可能来自北美洲。     

鹅细小病毒C日v强毒株VP3基因克隆及遗传进化

根据Genbank中的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计合成一对引物,应用PCR技术扩增了GPV强毒株CHv的VP3基因片段,将扩增后的VP3基因重组到pMD18-T质粒载体上,并对擂人片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV,M DPV,PPV和CPV等不同宿主的细小病毒的VP3进行比对分析.结果表明:中国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1 605 bp,编码 534个氨基酸,与国内外10株GPV的VP3基因进行比较,核苷酸同源性为93.4%-99.8%,氨基酸同源性为96.5%99.3%,其变异较小,是GPV保持一个血清型的分子基础.与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%和89.9%,而与其他种属的细小病毒同源性均在30%以下,表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远.     

猪2型圆环病毒福建析的全基因组克隆与序列分析

根据已发表猪2型圆环病毒PCV2序列设计两对特异性扩增引物对福建龙岩市某规模化猪场疑似PCV2感染病例进行PCV2的检测与全基因组克隆,经测序与序列拼接,获得了PCV2福建株全基因组序列PCV2-LY.序列分析结果表明,PCV2-LY全长1767 bp,与国内外各分离株同源性在95.1 %-98.0%之间,ORF1氨基酸同源性在97.1%-99.6%之间,而ORF2氨基酸同源性在92.7%-99.1%之间     

马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)ORF2a基因5''''端的克隆和序列分析

用设计合成的一对特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国株PLRV—Ch的RNA为模板，经反转录PCR扩增，将获得ORF2a的5′端0．6kb cDNA克隆于pUC19中，构建成重组质粒pLR8．PCR检测和酶切检测表明，获得了ORF2a的5′端0．6kb cDNA克隆，从该cDNA两端进行了两次序列分析，并将获得的核苷酸序列与国外报道的4个PLRV分离株的相应区域的同源性进行了比较，5个序列间具高度同源性。     

马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)ORF2a基因5′端的克隆和序列分析

用设计合成的一对特异性引物,以马铃薯卷叶病毒中国株PLRV-Ch的RNA为模板,经反转录PCR扩增,将获得ORF2a的5′端0.6kbcDNA克隆于pUC19中,构建成重组质粒pLR8.PCR检测和酶切检测表明,获得了ORF2a的5′端0.6kbcDNA克隆,从该cDNA两端进行了两次序列分析,并将获得的核苷酸序列与国外报道的4个PLRV分离株的相应区域的同源性进行了比较,5个序列间具高度同源性.     

鹅细小病毒CHv强毒株VP3基因克隆及遗传进化

根据Genbank中的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计合成一对引物,应用PCR技术扩增了GPV强毒株CHv的VP3基因片段,将扩增后的VP3基因重组到pMD18-T质粒载体上,并对插入片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV、MDPV、PPV和CPV等不同宿主的细小病毒的VP3进行比对分析。结果表明:中国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1 605 bp,编码534个氨基酸,与国内外10株GPV的VP3基因进行比较,核苷酸同源性为93.4%~99.8%,氨基酸同源性为96.5%~99.3%,其变异较小,是GPV保持一个血清型的分子基础。与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%和89.9%,而与其他种属的细小病毒同源性均在30%以下,表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的表达与纯化

根据GenBank报道的PRRSV VR2332基因序列设计引物,经RT - PCR扩增,得到大小约为390 bp的阳性产物;利用Bam H Ⅰ,EcoR Ⅰ位点将N蛋白基因片段克隆到pET-28a载体,构建原核重组表达质粒pET-N,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE,Western blot分析.结果表明:克隆的N蛋白基因与GenBank报道的VR2332基因同源性为93.83％;重组菌株经IPTG诱导后,N蛋白基因得到了高效表达;经筛选得到最佳诱导条件,即1 mmol/L IPTG诱导6h,蛋白表达量可达菌体蛋白总量的52.635％,SDS-PAGE后切胶回收可得到纯化的N蛋白,为进一步制备免疫胶体金试纸条或ELISA试剂盒提供基础.     

猪繁殖与呼吸障碍综合征的RT-PCR诊断

根据猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的全基因组序列,设计合成一对特异性引物,建立检测PRRSV的RT-PCR方法。对两份疑似病料进行检测,结果两份均为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒阳性。结合流行病学,临床症状以及病理解剖变化,诊断为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒感染。     

Molecular characterization of H1N1 influenza A viruses from human cases in North America

Subtypes of H1N1 influenza virus can be found in humans in North America, while they are also associated with the infection of swine. Characterization of the genotypes of viral strains in human populations is important to understand the source and distribution of viral strains. Genomic and protein sequences of 10 isolates of the 2009 outbreak of influenza A （H1N1） virus in North America were obtained from GenBank database. To characterize the genotypes of these viruses, phylogenetic trees of genes PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, NS and M were constructed by Phylip3.67 program and N-Linked glycosylation sites of HA, NA, PB2, NS1 and M2 proteins were analyzed online by NetNGlyc1.0 program. Phylogenetic analysis indicated that these isolates are virtually identical but may be recombinant viruses because their genomic fragments come from different viruses. The isolates also contain a characteristic lowly pathogenic amino acid motif at their HA cleavage sites （IPSIQSR↓GL）, and an E residue at position 627 of the PB2 protein which shows its high affinity to humans. The homologous model of M proteins showed that the viruses had obtained the ability of anti-amantadine due to the mutation at the drug-sensitive site, while sequence analysis of NA proteins indicated that the viruses are still susceptible to the neuraminidase inhibitor drug （i.e. oseltamivir and zanamivir） because no mutations have been observed. Our results strongly suggested that the viruses responsible for the 2009 outbreaks of influenza A （H1N1） virus have the ability to cross species barriers to infect human and mammalian animals based on molecular analysis. These findings may further facilitate the therapy and prevention of possible transmission from North America to other countries.     

快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

在猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）的5′端非编码区设计一对引物和一条TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了特异性检测HCLV的荧光定量RT-PCR方法．结果表明：该方法检测的最低拷贝数为45拷贝／μL,灵敏度比普通PCR方法高10^4倍,在较广的范围内（4．5×10^1-4．5×10^6拷贝／μL）有良好的线性关系（r=0．994）;分别以乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、副猪嗜血杆菌、牛病毒性腹泻,黏膜病病毒作为模板进行TaqMan RT-PCR扩增,未出现阳性信号：4个不同浓度标准品组内试验变异系数为1．90％～5．82％,组间试验变异系数为4．02％～5．69％：HCLV3个cDNA样本组内试验变异系数为3．72％～4．93％;组间试验变异系数为2．99％～4．02％．该方法具有很好的灵敏性、特异性及稳定性,能够快速准确定量检测HCLV,为HCLV疫苗的研制、猪瘟病毒分子生物学等方面研究提供了一种快捷有效的工具．     

海芒果可培养细菌的分离鉴定及其抑制海洋鱼类致病菌活性研究

【目的】研究红树植物海芒果Cerbera manghas L.及其根际土壤可培养细菌多样性及其代谢产物抑制鱼类致病菌的生物活性。【方法】采用纯培养法分离并基于16SrRNA基因序列的系统发育分析法对分离得到的细菌进行多样性研究,采用滤纸片法研究其抑制海洋鱼类致病菌的生物活性。【结果】从海芒果及其根际土壤中共分离得到15株可培养细菌,采用16SrRNA基因序列的系统发育分析后发现,这些菌分属于2个大的细菌发育类群:厚壁菌门(Firmicutes,占比为53%)和放线菌门(Actinobacteria,占比为47%),其中4株为芽孢杆菌属,6株为链霉菌属。活性研究发现,所有测试菌株对3种海洋鱼类致病弧菌均有一定的抑制作用,其中VT86(Kitasatospora paranensis),V139-2(Streptomyces luteireticuli),V140-2(Streptomyces jiujiangensis),VT19(Streptomyces orinoci),VT113(Streptomyces niveiscabiei)这5株菌的抑菌效果较好,以VT86(K.paranensis)抑菌活性最好。【结论】红树植物海芒果及其根际土壤中的细菌丰富多样,部分细菌具有抑制海洋鱼类致病菌生长的生物活性,具有开发成新型抑制鱼类致病菌药物的潜力。     

马立克氏病病毒meq基因功能研究

从马立克氏病病毒（MDV）不同致病型毒株meq基因序列，meq基因产物及其细胞内表达特性和meq蛋白生物学功能的研究探讨马立克氏病病毒致瘤基因meq功能。完成了648A,CV1988/Rispens,814，广西地方毒株G2，N，0093，0095，0297，0304共9个MDV毒株meq基因的序列测定。MDV不同致病型毒株的meq基因序列相对比较保守，它们相互间核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高；与所有7个致瘤的MDV毒株相比，在2个MDV-1弱毒疫苗CV1988/Rispens株和814株发现有二个特征性位点突变。此外，还在其ORF中首次发现含15个氨基酸残基（EELCAQLCSTPPPPI）的2个重复和含6个氨基酸残基（PPICTP）的4个重复，全分布在MEQ蛋白C-端的转录激活域内。MEQ蛋白的表达仅局限于感染细胞的核内，而且随感染时间增加。具有从核质向核仁和核膜转移趋向；Western Blotting和免疫沉淀试验证实重组杆状病毒感染细胞裂解物中有大小约为60kD的特异带，利用表达的MEQ蛋白产物免疫BALB/c小鼠，获得的杂交瘤细胞被克隆并与MDV感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）做免疫荧光试验（FA），获得4株稳定产生抗MEQ蛋白单克隆抗体（McAb)的杂交瘤细胞，其中3G12E6单克隆抗体能够检测到MDV致瘤株感染的CEF及自然MD肿瘤细胞中表达的meq基因产物，而CV1988/Rispens感染的细胞则未检测到，发现细胞内表达的meq基因产物可明显促进MDVGA株对体外培养细胞的感染及增殖。研究结果表明，meq基因在感染细胞内的表达水平是MDV增殖和致病，致瘤的分子基因。