小立碗藓-灰霉菌互作过程中活性氧代谢及病程相关蛋白1转录表达的变化

为了解苔藓植物小立碗藓与病原真菌灰霉菌的互作关系,观察了灰霉菌在小立碗藓配子体中的感染行为和小立碗藓受感染后的组织病理学变化.另外,还测定了接种灰霉菌后小立碗藓配子体的过氧化氢量、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及病程相关蛋白1(PR1)基因转录表达变化.结果表明:(i)在灰霉菌接种早期小立碗藓出现类似维管束植物的过敏性反应;(ii)接种早期PR1基因表达上调和POD活性增高,说明PR1和POD可能与小立碗藓对灰霉菌的早期防御反应有关;(iii)病原菌侵染引起小立碗藓配子体内CAT、SOD活性下降和过氧化氢量升高,说明小立碗藓与灰霉菌互作中出现了氧化还原态的变化.     

小立碗藓的中国新分布区报道

报道了葫芦藓科内蒙古新纪录属小立碗藓属和新纪录种小立碗藓,标本采集于内蒙古自治区呼和浩特市清水河县和鄂尔多斯市准格尔旗黄河岸边冲刷地.对小立碗藓的形态学特征、分布和生境进行了描述,提供了植物体显微照片,并更新了内蒙古葫芦藓科分属检索表,凭证标本存于内蒙古师范大学苔藓植物标本室.     

大肠杆菌O157中肽聚糖水解酶MpaA的克隆、表达、纯化及晶体学研究

采用分子克隆方法将来源于大肠杆菌O157的mpaA基因构建入pET-21b(+)表达载体.诱导MpaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达,通过Ni亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析三步法纯化得到高纯度蛋白.使用气象扩散法进行蛋白质晶体生长的初步筛选与优化,得到MpaA蛋白质单晶,并使用X射线衍射仪进行衍射数据的收集与处理.MpaA晶体分辨率为0.26 nm,属于P31空间群,晶胞参数为a=5.989 3 nm,b=5.989 3 nm,c=12.987 0 nm,β=90.000 °.MpaA晶体衍射数据的收集为后续结构解析和催化机制的阐明提供了基础.     

人源Pelota C端结构域的纯化、结晶及晶体结构分析

Pelota在进化上是非常保守的RNA结合蛋白,人源Pelota mRNA分布于几乎所有的组织并作为一个多功能的蛋白参与多种生物途径.为解析人源Pelota C端结构域(C-terminal domain,CTD)的晶体结构,首先在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达,并采用亲和层析、凝胶过滤柱层析的方法,获得了纯度大于97%的蛋白.动态光散射实验表明纯化的蛋白有较高的均一性.在筛选了1 852个结晶条件后,优化的人源Pelota CTD蛋白晶体能衍射X射线至0.26nm分辨率.蛋白晶体的空间群为P6522,晶胞常数a=7.882nm,b=7.882nm,c=19.746nm.上述结果为进一步研究Pelota的功能及其与下游蛋白的相互作用奠定了结构基础.     

植物激素对小立碗藓愈伤组织诱导及分化影响

小立碗藓(Physcomitrella patens(Hewd.)B.S.G.)作为独特的模式植物在分子生物学研究中被广泛应用.本实验以改良的Knop培养基为基本培养基,研究添加不同种类和浓度配比的植物激素对小立碗藓愈伤组织诱导及分化的影响.实验结果表明当糖浓度为2%,添加KT 0.05 mg·L-1或添加6-BA 0.05 mg·L-1,在温度(25±1)℃,光照强度3000～4000lx,光照周期12/12 h/d条件下培养,诱导小立碗藓愈伤组织的效果最为理想.诱导愈伤组织分化的实验结果表明未添加任何植物激素的Knop培养基上分化出正常的配子体且数量最多.添加2,4-D或IAA的培养基上能长出较多的原丝体.     

苔藓分子生物学的一些进展

本文简述了近年来苔藓分子生物学的突破性进展。 1995年以前 ,苔藓系统学中尚无DNA序列数据 ,但到 1999年产生了 2 5 0个分类单位的 10 0 0个DNA序列 ,并分析了它们的系统发生信息。在分子遗传学研究中 ,小立碗藓Physcomitrellapatens、葫芦藓Funariahygrometrica、土生墙藓Tortularuralis和角齿藓Cer atodonpurpureus正在发展成有力的工具。表达序列靶 (ESTs)和外源基因的表达已成功地用于这些苔藓植物。同源重组在酵母和小白鼠细胞中已经确定 ,然而至今尚无任何植物模型体系。 1997年Schaefer和Zryd证明 ,小立碗藓具有有效的同源重组能力 ,至今在所有植物中是独特的 ,这在分析植物基因功能中将显示是十分有用的     

小立碗藓CAS基因的克隆及与拟南芥CAS基因的比较

钙信号在动植物的生长、发育过程中具有不可替代的作用.胞外钙受体(Extracellular Calcium-sensing receptor,CAS)是动植物质膜上一种跨膜离子通道蛋白,可以感受胞外Ca2 水平,充当第一信使将胞外的信号传递到细胞内.但迄今为止,仅2003年从植物拟南芥中克隆了胞外钙受体CAS基因,其起源进化我们知之甚少.本实验成功克隆了小立碗藓CAS基因,其cDNA全序列共1 574 bp,5′-非翻译区80个核苷酸,3′-非翻译区234个核苷酸,开放阅读框(ORF)1 257 bp,编码419个氨基酸,共有6个内含子.虽然藓类植物与被子植物进化距离较远,但小立碗藓CAS基因前五个内含子的插入位置以及相位与拟南芥完全相同,这说明植物中CAS基因在漫长的进化过程中非常保守,暗示被子植物胞外钙离子信号感受、传递机制起源于藓类植物.     

编码真核启动因子4E的毛尖紫萼藓基因GH425电子克隆及验证分析

GH425基因(genebank EST#:GPE204)来自毛尖紫萼藓干旱胁迫cDNA文库。本实验在小立碗藓核酸数据库中,以GH425基因为基因探针进行电子克隆,最终得到全长序列GH425NO.1。经ORFfinder分析,以最长ORF设计引物,对毛尖紫萼藓进行RT-PCR验证,得到了与之对应的条带,证明了毛尖紫萼藓中含有电子克隆的片段,即电子克隆结果正确。经Blastx分析,确定该序列编码真核启动因子4E。     

铜绿假单胞菌PAO1亚精胺脱氢酶SpdH的表达、纯化和初步晶体学研究

铜绿假单胞菌是一种具有很强环境适应性的机会致病菌,感染后通常很难治愈从而造成很严重的后果.聚胺类化学物质在很多种生物体内广泛存在,并且在细胞内发挥多种重要的功能.铜绿假单胞菌 PAO1可以利用聚胺类物质作为菌体生长所需的唯一的碳源和氮源,亚精胺脱氢酶(SpdH)在铜绿假单胞菌亚精胺代谢过程中发挥重要的作用.本研究在大肠杆菌中成功表达了可溶性SpdH蛋白,并经过多种方法纯化后筛选获得了蛋白质晶体,通过X射线衍射实验收集到分辨率达到0.185 nm的衍射数据,并使用 HKL2000软件对衍射数据进行了处理,这些数据为SpdH结构的解析奠定了基础.     

神舟八号飞船空间蛋白质结晶实验

 利用德国空间生物实验装置和自主研制的结晶室,在中国神舟八号飞船上进行了14种蛋白质的结晶实验,实验持续16.5d;同时使用相同结晶室在地面开展比对实验.结果表明：12种蛋白质在空间析出晶体,地面有11种;空间析出的6种蛋白质晶体可用于X-射线衍射实验,收得4种晶体的8套同步辐射衍射数据;地面有5种蛋白质晶体可用于X-射线衍射,收得3种晶体的5套同步辐射衍射数据,其中1套不完整.鸡蛋清溶菌酶空间晶体的初步衍射最高分辨率为1.16Å,地面晶体的为1.23Å.痢疾杆菌二磷酸四腺苷空间晶体初步衍射最高分辨率为1.75Å,地面晶体的为1.49Å,但是1颗空间晶体的晶型发生改变.衣原体蛋白酶样活化因子空间晶体的初步衍射最高分辨率为2.31Å,地面晶体未得到衍射数据.加拿大的17β-羟化类固醇脱氢酶复合物空间晶体的初步衍射最高分辨率为2.30Å,地面晶体未得到完整衍射数据.自主研制的结晶室的浸入式毛细管结构为国际上首次采用,具有无源和通用的优点,对汽相扩散结晶法具有良好的自然对流抑制效果.     

睾丸酮丛毛单胞菌CNB1中2–氨基–5–氯粘康酸半醛脱氢酶的表达纯化与结晶

硝基苯类化合物作为一种重要的化工原料,在工业广泛应用的同时也产生了环境污染.目前降解硝基苯类污染物的方法有物理法、化学法和生物法,其中生物修复法具有低成本、无二次污染、生态恢复性好等优点.硝基苯类化合物中的对氯硝基苯是一种高毒、危险的合成品,会对人体造成直接或间接的生理损伤.来源于睾丸酮丛毛单胞菌CNB1(Comamonas testosteroni CNB1)的2–氨基–5–氯粘康酸半醛脱氢酶(2-amino-5-chloromuconic semialdehyde dehydrogenase,Cnb D)是对氯硝基苯降解通路中的关键酶.研究Cnb D的晶体结构有助于完善生物修复治理对氯硝基苯污染的机制.实验以睾丸酮丛毛单胞菌CNB1中的Cnb D为研究对象,将基因cnb D克隆到p ET-28,a(+)上进行原核表达.通过镍离子亲和层析和凝胶过滤层析等纯化方法获得重组蛋白Cnb D.在289,K下获取了2种重组蛋白Cnb D晶体,并在同步辐射光源BL19,U光束线的0.10,nm波长X射线衍射下得到最高衍射分辨率分别为0.18,nm和0.22,nm的衍射数据.采用分子置换法,初步解析了Cnb D的同源四聚体结构.     

基因功能研究新技术———新的晶体解析方法

建立了包含 5 0 0多种筛选条件的蛋白结晶系统 ,提高了获得蛋白晶体的概率 .目前 ,已对 3种新基因编码蛋白进行晶体培养 ,其中一种新基因蛋白已经得到单晶 ,为解析该蛋白结构做好了准备 .同时 ,结合已建立的大规模蛋白原核分泌表达与纯化技术系统 ,将对大量新基因编码蛋白进行晶体培养条件的筛选 ,为大规模结构生物学研究和新基因功能 结构关系分析奠定了基础 .已成功制备了耐热邻苯二酚 2 ,3 双加氧酶、耐热碱性磷酸酯酶的蛋白质晶体 ,并收集了Ｘ 衍射数据 .在国内首次获得了硒化耐热邻苯二酚 2 ,3 双加氧酶的晶体 ,在日本的同步辐射光源上…     

牙龈卟啉单胞菌蛋白酶Tpr的表达、纯化和初步晶体学研究

牙龈卟啉单胞菌是一种能够引起牙周炎的口腔病原菌,能够分泌许多种蛋白酶.这些蛋白酶在获得营养、逃脱宿主免疫、粘连组织细胞和其它疾病进程中发挥了重要作用,被认为是牙周炎的重要致病因子.其中一种蛋白酶是巯基蛋白酶Tpr,它能够降解许多常见蛋白酶的底物,其活性受到营养状态和钙离子浓度的调节.本实验在大肠杆菌中表达得到Tpr蛋白,经多种方法纯化后筛选获得蛋白质晶体.通过X射线衍射实验收集到分辨率达到0.20 nm的衍射数据,并使用软件HKL2000进行了处理.这些数据为解析Tpr3维晶体结构奠定了基础.     

鸡β_2-微球蛋白及其硒代衍生物的制备和晶体学研究

禽流感的暴发使得禽类免疫系统的研究显得愈加迫切.而以其他种属的同源β2-微球蛋白作为模板进行结构解析,不能解析鸡β2-微球蛋白(Chβ2m)的晶体结构.为了利用硒原子的反常散射获取Chβ2m晶体X射线衍射的相位信息.本研究以pET21a为表达载体,E coli BL21(DE3)为宿主菌,在含有硒代甲硫氨酸的M9培养基中,用IPTG诱导表达硒代甲硫氨酸Chβ2m.包涵体经提取和稀释复性法复性之后,通过分子筛层析和Resource Q阴离子交换层析进行纯化,产物经SDS-PAGE检验纯度达98%以上.利用悬滴气相扩散法采用与Chβ2m蛋白晶体生长相同的条件.获得了衍生物可供衍射的晶体.通过北京同步辐射装置收集数据,最高分辨率至1.9 A.     

嗜热光合酸杆菌Fenna-Matthews-Olson蛋白的分离、纯化与结晶

为了获得可用于X射线衍射分析的嗜热光合酸杆菌(Chloracidobacterium thermophilum,C.thermophilum)Fenna-Matthews-Olson (FMO)蛋白晶体,进一步探究FMO蛋白结构和功能,依次采用高浓度碳酸钠溶液浸泡、蔗糖密度梯度离心和二乙基氨基乙基葡聚糖凝胶阴离子交换层析方法,直接从嗜热光合酸杆菌中分离、纯化FMO蛋白;利用凝胶过滤层析及十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对该蛋白的均一性和纯度进行检测;分别使用坐滴法和悬滴法对蛋白结晶条件进行筛选和优化,并对优化的蛋白晶体进行X射线衍射分析。结果表明：制得的嗜热光合酸杆菌FMO蛋白纯度较高,性质均一;当温度为16℃、FMO蛋白质量浓度为15.0 g/L、池液中乙酸铵浓度为0.25 mol/L、缓冲液三羟甲基氨基甲烷-氯化氢浓度为0.1 mol/L、 pH为9.0,以及2-丙醇体积分数为32%时,可获得质量较好且最大衍射分辨率为0.235 nm的嗜热光合酸杆菌FMO蛋白晶体。     

结核分枝杆菌酰基辅酶A脱氢酶的晶体学初步研究

结核病是人类健康的重要威胁. 随着多药耐药和广泛耐药结核分枝杆菌菌株,以及结核分枝杆菌与人类免疫缺陷病毒共感染现象的出现,寻找新的更安全有效的药物靶标迫在眉睫. 对来自结核分枝杆菌的潜在药物靶标进行蛋白三维结构的阐释是研究抗结核药物的有力手段之一. 酰基辅酶A 脱氢酶在结核分枝杆菌的脂肪酸合成酶系统中发挥着重要的作用,有可能成为潜在的药物靶标. 在大肠杆菌中克隆表达了酰基辅酶A 脱氢酶蛋白FadE5,经多步蛋白质的纯化和结晶条件的筛选后,获得具有衍射能力的蛋白质晶体,并收集了分辨率为0.29 nm 的X-射线衍射数据. 这些实验和衍射数据都为FadE5 蛋白的晶体结构与功能的研究奠定了基础.     

具有多重互穿结构的配位聚合物[Co（bpe）4（CNS）2]n

采用1,2-二（4-吡啶）乙烯,硫氰酸铵和乙酸钴在水热条件下合成了配位聚合物[Co（bpe）4（CNS）2]n（bpe=1,2-二（4-吡啶）乙烯,CNS=硫氰酸根）,并通过元素分析、x-射线单晶衍射等技术对其结构进行了表征。配合物属四方晶系,空间群为14;晶体学参数：α=1．5897nm,b=1．5897nm,C=1．5446nm;β=90°,V=3．903nm^3,Z=4,R1=0．0784,wR2=0．1908。晶体的基本构建基元包含一个钴（Ⅱ）原子,四个1,2-二（4-吡啶）乙烯,两个无序的硫氰酸根,其中每个Co（Ⅱ）原子与四个1,2-二（4-吡啶）乙烯相连形成了具有菱形格子的[4,4]二维网,有趣的是,沿C轴加角为90。的的二维网又互穿构筑了2D→D的配位聚合网络。     

刚性有机胺导向的IVA族卤化物杂化聚合物{[H2TEDA][(PbI3)NO3]·H2O}n的合成和晶体结构

报道一个在水热条件下合成得到的刚性有机胺(质子化的三乙烯二胺)导向的新颖杂化聚合物{[(H2TEDA) (PbI3)NO3]·H2O}n(1).用X-射线衍射进行结构确定,并对其进行红外、紫外光谱表征.结构解析表明,标题物晶体属于正交晶系,Pbam空间群,晶胞参数为a=26.884 (5) nm,b=7.8420(16...     

磷酸乙醇胺转移酶MCR1结构与功能的研究

本实验克隆了来源于E.coli的MCR1基因酶催化结构域,以E.coli表达系统表达蛋白.采用亲和层析、阴离子交换层析、分子筛层析等纯化方法获得纯度高、均一性好的蛋白;采用座滴和悬滴法,获得酶催化区域的蛋白质晶体;收集X射线数据后,分子置换法解析出酶催化区域的结构,其分辨率达到1.63埃.反常散射信号检测到4个锌离子信号,结构分析锌离子与周围Thr285、His465、His466、His395位氨基酸联系紧密,且Thr285被磷酸化.Thr285、His465、His466和His395点突变为丙氨酸后,宿主菌粘菌素抗性显著降低,表明该区域与酶活密切相关.本实验解析出MCR1酶活性区域的结构,鉴定出酶活性中心,为寻找抗MCR1靶向药物提供可用信息.     

[(C_5H_5FeC_5H_4)_2CR,R′](R=CH_3;R′=C_3H_7,CH_2Ph)的晶体和分子结构

用浓硫酸-甲醇为催化剂,在85-90℃反应温度下,进行二茂铁与酮或醛的非均相缩合反应,合成了标题化合物.用Al_2O_3色谱柱提纯,苯加石油醚培养晶体.晶体在CAD-4四园衍射仪上MoK_α射线收集衍射数据,PDP11/44计算机上进行结构解析,结晶学数据见表1,文中对化合物的结构作了讨论.