出芽酵母蛋白激酶TOS3的过量表达及其在热胁迫应答中的作用

出芽酵母SNF1蛋白激酶参与葡萄糖阻遏和细胞胁迫应答.TOS3可通过磷酸化激活SNF1,参与SNF1调控的信号途径.本研究利用PCR方法扩增tos3基因的蛋白质编码序列,克隆到多拷贝表达载体pYES2/NTA上构建真核表达载体,转化酵母细胞并诱导TOS3过量表达.带HIS6标签的重组TOS3蛋白通过免疫印迹得以鉴定.进一步研究了过量表达TOS3对细胞热胁迫耐受性的影响,发现在热胁迫处理条件下,TOS3过量表达可恢复△snf1突变体细胞的生长缺陷,表明TOS3可能通过不依赖SNF1的其他信号途径参与细胞对热胁迫应答的调控.     

禽流感病毒H5N1亚型RNA聚合酶蛋白表达纯化及晶体生长

通过使用原核表达载体大量表达H5N1病毒RNA聚合酶亚基PA-C257,PB1_N25,再经过GST亲和层析和Sephadex G-200层析柱纯化,获得了高纯度的蛋白复合体.采用悬滴气相扩散法筛选蛋白晶体,在1～1.5mol/L乙酸钠和pH7.9条件下获得了理想的晶体,为解析禽流感病毒RNA聚合酶三维结构并进一步认识其生物功能奠定了基础.     

光合细菌捕光色素蛋白复合体LH2的结构与功能

概述了近年采光合细菌捕光色素蛋白复合体LH2的结构研究状况,并在此基础上阐述了各组分的功能、特点及相互作用.     

联会复合体蛋白SYCP2 C-末端的表达、结晶及晶体初步分析

联会复合体蛋白2(SYCP2)作为减数分裂过程中表达的特异性蛋白,是联会复合体轴向组分之一.许多研究表明SYCP2对联会复合体正确组装/去组装可能起着重要作用,尤其是C末端,但具体机制尚不清楚.对鼠源的SYCP2-CTR进行了表达、纯化并用坐滴气相扩散法进行了结晶和优化.在日本PEK收集了1套分辨率为0.4 nm的数据.晶体的空间群为C2,晶胞参数a=16.325 1,b=7.426,7 c=14.823 nm;α=γ=90?,β=119.464?.1个不对称单位4个分子,其溶剂量约为46%.     

利用酵母双杂交系统筛选甘蓝型油菜ATP6的相互作用蛋白质

通过酵母双杂交系统,以ATP6作为诱饵蛋白筛选与ATP6有相互作用的蛋白质.通过筛选和鉴定,获得了5个与ATP6有相互作用的蛋白质.其中一个与拟南芥中内质网膜上的蛋白转运复合体中的α亚基（Sec61α）有很高的相似性.通过TAIL PCR和设计简并引物扩增初步得到了甘蓝型油菜Sec61α全长基因组序列和cDNA序列.并利用生物信息学分析手段对甘蓝型油菜Sec61α进行了比对和分析,推测该蛋白质可能参与了花粉的发育过程.     

蓝隐藻藻蓝蛋白亚基的分离及特性研究

以纯化的蓝隐藻(Chroomonas plaoidea)藻蓝蛋白PC645为材料,经尿素变性、分子筛层析以及SDS-PAGE与IEF电泳技术分离、纯化其2类不同亚基,并测定了亚基的吸收光谱、荧光谱、等电点以及pH耐受性等.结果表明,隐藻PC645异二聚体的亚基结构稳定,8 mol/L尿素处理48 h方可令A_(645)=10的PC645样品变性完全.SDS-PAGE与IEF电泳结果表明,经Sephacryl S-100层析得到的α与β亚基组分达到了完全分离的效果,并证实PC645存在分子质量和等电点均不相同的2种β亚基.光谱分析显示,分离后的α和β亚基依然保持光谱活性,其中β亚基是PC645的660 nm特征荧光发射位点,并且在pH值为4.92的磷酸缓冲液中可保持45 d内光谱形态稳定;而α亚基所含的MBV色基不产生荧光,亚基的pH耐受性以pH值为7左右为最佳.实验结果将为研究藻蓝蛋白的亚基结构、能量传递途径等提供相应理论依据,并为进一步的亚基序列分析奠定了基础.     

COG复合体亚基COG2和COG3之间相互作用的研究

真核细胞内的囊泡运输过程分为四个环节:囊泡的出芽、运输、栓系和融合.这其中的囊泡栓系过程是由栓系因子所介导的.位于高尔基体上的一类栓系因子COG复合体在介导高尔基体内部的囊泡逆向运输过程中发挥着重要的作用.COG复合体由八个亚基组成,本文首先通过基因克隆的方法,克隆获得两个COG亚基COG2和COG3的基因.随后的工作中,通过两种蛋白质之间互作的检测方法,进一步地证明了COG2和COG3两个亚基之间存在着相互作用.     

用酵母双杂交系统研究铜绿假单胞菌 EtfA 和 EtfB 蛋白的相互作用

EtfA蛋白与EtfB蛋白是铜绿假单胞菌etfA基因和etfB基因编码的蛋白质,分别构成电子传递黄素蛋白的α亚基和β亚基.应用酵母双杂交系统对EtfA和EtfB蛋白之间的相互作用进行研究,发现EtfA与EtfB之间存在较强的蛋白质间相互作用,说明铜绿假单胞菌的电子传递黄素蛋白是以异源二聚体的形式存在于细胞内的;并推测EtfA和EtfB是电子传递链的重要组分,可能为细菌鞭毛的旋转提供能量.     

人类线粒体转录因子B1和B2与裂殖酵母线粒体转录聚合酶Rpo41相互作用的初步研究

由L02型人肝脏细胞cDNA通过PCR技术获取到线粒体转录因子B1和B2的ORF片段(NM_022366和NM_016020);构建表达质粒pGEX-4t-1/GST-mtTFB1及pMAL-c-2X/MBP-mtTFB2,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析,分子筛和阳离子交换柱得到纯度较高的蛋白.利用体外pull-down实验证实TFB1和TFB2均与来源于裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的线粒体RNA聚合酶(Rpo41)存在分子间相互作用.在裂殖酵母中过表达h-TFB1和h-TFB2,利用实时荧光定量PCR检测,2个蛋白在酵母体内均对线粒体基因转录产生影响.     

重组人源METTL3蛋白的表达与纯化

m6A受到甲基转移酶(METTL3,METTL14,WTAP等)/去甲基化酶(FTO,ALKBH5等)以及一些RNA 结合蛋白(YTHDF1/2/3, ELAVL1 等)的共同调控,在细胞内是一个动态可逆的过程 . 甲基化转移酶METTL3 是甲基转移酶复合物中重要的组成部分,参与调控真核生物mRNA的甲基化水平.目前关于METTL3的分子结构基础以及整个甲基化转移酶的复合物的组装机制还不是很清楚.本研究中构建了原核表达载体pET.32M.3C-METTL3 ^(1-305) ,利用大肠杆菌原核表达系统表达出了可溶性的目的蛋白,通过镍柱亲和层析,凝胶过滤层析以及离子交换层析获得了纯度高,构象均一的蛋白METTL3 ^(1-305) .除此以外,还分别利用超速离心和圆二色谱的技术对蛋白的构象以及二级结构进行了分析.已获得的高纯度融合蛋白METTL3 ^(1-305) ,为进一步研究METTL3蛋白的结构以及与复合体其他成分之间的相互作用提供了一定的基础.     

pMAL-p2X系统表达SLA-Ⅰ复合体蛋白

SLA-Ⅰ/pMAL-p2X为人工构建的原核表达体系.为获取最佳表达的SLA-Ⅰ复合体蛋白及其可溶性表达含量,设计实验对其进行表达优化(pH值、温度、菌体密度、IPTG浓度、诱导时间),SDS-PAGE检查目的蛋白的表达.另外检查目的蛋白的可溶性表达含量.结果显示,SLA-Ⅰ在pMAL-p2X的最佳表达条件为pH=8.0、T(温度)=37 ℃、OD600=1.0、IPTG=0.4 mmol/L和t(诱导时间)=5 h;证明目的蛋白可溶性表达含量占总表达蛋白的70%左右.研究表明pMAL-p2X系统适合于生产可溶性的SLA-Ⅰ复合体蛋白,便于今后进一步研究SLA-Ⅰ类分子结构和功能.     

款冬提取物对PICK1蛋白功能的影响

蛋白激酶Cα相互作用蛋白(PICK1)的PDZ结构域介导了PICK1和AMPAR的亚基GluR2的C末端结合,在GluR2下调引起兴奋性毒性而产生的多种神经性疾病中,PICK1的PDZ结构域是一个潜在的药物靶标.文章将重组质粒pET3a-pick1和pET-3C-GB-pdz转入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,在大肠杆菌中获得重组表达,目的蛋白经硫酸铵沉淀或Ni 2+-NTA Sepharose 4Bcolumn亲和层析,再经Sephacryl S-200凝胶层析纯化得到了PICK1和GB-PDZ蛋白.利用荧光光谱法初步分析了款冬提取物与PICK1及其不同结构域的结合情况,结果表明款冬提取物与PICK1的结合位点位于PDZ结构域,款冬提取物能有效抑制PDZ结构域与GluR2的相互作用.     

重组Pol D DNA聚合酶的纯化及其功能初步研究

为研究古菌Pol D DNA聚合酶两个亚基的功能及其相互作用,对重组超嗜热硫还原古菌Thermococcus sp.4557 Pol D DNA聚合酶小亚基DP1和大亚基DP2进行柱层析纯化,采用荧光标记核酸结合聚丙烯酰胺凝胶电泳实验对两个亚基体外功能进行研究。结果表明,DP2具有DNA复制延伸活性,DP1具有3′→5′外切核酸酶活性;DP1在与DP2的浓度比高于0.3∶1时可降解DP2的延伸产物;DP2对DP1的外切核酸酶活性有促进作用,Sld5和Psf1蛋白复合体(Sld5 and Psf1 Complex, GINS 51)对DP1的外切核酸酶活性有抑制作用。古菌Pol D DNA聚合酶大小亚基的功能及其相互作用对DNA复制机制的进一步认识有借鉴意义。     

南方水牛奶酪蛋白及大豆蛋白肽指纹图谱的差异性

通过LTQ Orbitrap XL组合型傅里叶变换高分辨质谱与反相高效液相色谱技术联用建立了南方水牛奶酪蛋白和大豆蛋白主要组分肽质指纹图谱,并对其氨基酸组成与序列进行了比较.结果表明:酪蛋白经胰蛋白酶酶解后得到的28个肽段中没有检测到与酶解大豆分离蛋白181个肽段相匹配的肽段;酪蛋白(CN)的主要组分是αs1-CN、β-CN、κ-CN,大豆蛋白的主要组分为大豆球蛋白(包括大豆球蛋白G1~G5亚基)和β伴大豆球蛋白(α,α',β链);水牛奶酪蛋白和大豆蛋白在亚基组分的氨基酸数量、组成比例和排列方式均呈现出明显的差异,大豆蛋白的各组分亚基的氨基酸全序列均大于酪蛋白各组分的氨基酸全序列,且大豆蛋白各组分的分子质量均显著高于酪蛋白各组分.LTQ Orbitrap XL质谱技术对乳源蛋白肽质指纹的分析,为今后鉴定分析牛奶蛋白中是否添加廉价蛋白提供了高精度和高准确度的检测方法,也为复杂混合物中的痕量组分检测提供了理论依据.     

人抗增殖蛋白Tob与其配体蛋白的相互作用及功能研究

抗增殖蛋白Tob作为BTG/TOB家族成员之一,对细胞增殖与mRNA降解具有重要作用.在磷酸激酶Erk1和Erk2的作用下,Tob中的3个丝氨酸位点可以进行磷酸化.已有大量研究表明Tob通过与去腺苷酸化酶中的核糖核酸酶D家族成员之一的Caf1相互作用于mRNA 3′端,共同组成去腺苷酸化酶复合体.同时,Tob对胞质多聚腺苷酸化因子结合蛋白3(CPEB3)对蛋白表达的负调控具有抑制作用.并且,Tob可以与多聚腺苷酸结合蛋白(PABP)相互作用,促进细胞内mRNA脱腺苷化.通过对Tob的3个参与磷酸化的丝氨酸位点进行突变,分别研究了人源野生型与丝氨酸突变型Tob对其与人源Caf1,PABP及CPEB3相互作用及多聚腺苷酸降解过程的影响.     

应用酵母双杂交系统筛选与NAP1相互作用的蛋白质

用NAP1作为"诱饵"蛋白,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,鉴定阳性克隆;再利用酵母双杂交和免疫共沉淀验证相互作用. 结果表明,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,阳性克隆的鉴定,发现了与NAP1的相互作用蛋白质―蛋白酶体α亚基3(PSMA3). 免疫共沉淀(Co-IP)结果证实外源表达的NAP1蛋白和PSMA3蛋白在293T细胞中有特异性的相互作用. NAP1作为FDC分泌的一种多肽,与PSMA3有特异性的相互作用,这种相互作用如何实现对蛋白酶体降解靶蛋白的活性调节,其作用机理有待深入研究.     

重组植物AHA2蛋白的真核表达及纯化

AHA2蛋白位于植物细胞质膜上,该蛋白在原核蛋白表达体系中无法重组表达.已经报道的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达体系操作复杂,成本高昂.本文将拟南芥aha2基因(全长2984bp)插入真核表达载体pPICZαA中,线性化质粒pPICZαA-aha2,电转化毕赤酵母X33细胞,通过同源重组获得工程菌.以0.5%甲醇诱导表达72h后,收获细胞.冷冻研磨细胞,离心并收集上清进行亲和层析和分子筛纯化.SDS-PAGE分析结果显示,目的蛋白为97kD的条带.本研究成功的在毕赤酵母X33细胞中实现了拟南芥AHA2蛋白的表达和纯化.     

水稻染色质重塑因子OsSWIB1的表达分析及其突变体的创建

SWI/SNF家族是ATP依赖的染色质重塑复合物，对基因的表达调控具有重要作用.为了探究水稻中染色质重塑因子OsSWIB1的功能，对OsSWIB1基因表达模式进行分析.结果表明：OsSWIB1在水稻的叶、叶鞘及穗中表达量较高，而在茎、茎顶端分生组织及根中表达量较低；在水稻不同的生长发育时期，除在苗期表达量较低外，OsSWIB1在分蘖期、孕穗期、抽穗期及灌浆期均有较高表达.此外，OsSWIB1在短日照条件下的表达明显高于在长日照条件下的表达.利用CRISPR-Cas9技术对OsSWIB1基因进行靶向编辑，共获得20株T₀代转基因植株，通过测序分析，鉴定出3个纯合编辑的突变体.对1个杂合编辑突变体的后代进行分离，获得了1个缺失200 bp的纯合突变体.     

五氧化二磷气相沉积改性Hβ分子筛

采用化学气相沉积法,研究了五氧化二磷对Hβ分子筛酸性和孔结构的改性.XRD研究显示,没有新的物相生成.TPD和IR测试表明,五氧化二磷与Hβ分子筛中B r¨onsted酸性位存在着强相互作用,有新的弱酸中心产生.通过改性,强酸中心降低,弱酸中心增加,同时发现,被磷物种覆盖的部分酸中心经过氮气的吹扫能够得到恢复.N2吸附—脱附等温线研究表明,样品的N2吸附—脱附等温线为Ⅰ型和Ⅳ型的复合体.由于磷物种对孔道的堵塞,改性Hβ分子筛样品的比表面积、孔容以及平均孔半径均减小.以正癸烷异构化为模型反应对改性样品的异构化催化性能进行了考察,结果发现,改性后P t/Hβ催化剂上正癸烷异构化性能有明显的改善.     

拟南芥AtDWD与DDB1相互作用研究

本文通过酵母双杂交实验(Y2H)和双荧光互补实验(BIFC)分别从体外和体内条件下检测了AtDWD与CUL4型E3连接酶的底物识别蛋白结合蛋白DDB1a和DDB1b的相互作用,发现AtDWD与DDB1b有较强的相互作用,而与DDB1a的相互作用较弱,相互作用区域位于AtDWD的C末端部位.说明了AtDWD是潜在的CUL4型E3连接酶的底物识别亚基.此外,本文中还发现AtDWD过表达植株对冷冻胁迫更加敏感.AtDWD可能参与冷胁迫信号通路.