抑制铜绿假单胞菌生长的噬菌体K4基因的筛选

噬菌体基因组携带多种影响宿主菌生长的基因,是筛选新型抗菌素的可能靶位.本研究分别克隆铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)噬菌体K4携带的全部75个基因,在阿拉伯糖启动子控制下进行表达.实验结果表明,6个噬菌体基因的表达产物能够显著抑制宿主菌的生长.生物信息学分析显示,基因gp72编码的末端酶大亚基与噬菌体基因组包装过程相关,基因gp49编码假定的5′-3′核酸外切酶,其余4个基因编码产物未发现特定的蛋白结构域.利用脉冲场凝胶电泳分析宿主菌染色体DNA的完整性,在阿拉伯糖诱导5,h时,蛋白Gp17、Gp41、Gp72、Gp29和Gp49能够导致宿主菌染色体DNA的显著降解,这是抑制宿主菌生长的可能原因.蛋白Gp67对宿主菌染色体DNA没有影响,其抑制细胞生长的机制不同于其他蛋白.实验还发现,筛选基因的产物还能影响噬菌体的感染效率.本研究发现的抑制细菌生长的基因,能够为筛选新型抗菌素提供新的靶位.     

尿激酶短肽抑制剂的初步研究

以尿激酶为目标蛋白, 在噬菌体表面展示六肽库中对尿激酶的短肽类抑制剂进行了三轮特异性筛选. 提高噬菌体与尿激酶的比例及缩短作用时间从而提高筛选压力后, 与尿激酶亲和结合的噬菌体得到富集. 通过对第三轮筛选到的重组噬菌体的DNA序列分析, 获得一组相对保守的肽序列. 相应的合成短肽 NEPKAN 和VSPKVL 对尿激酶的抑制常数分别为32.5 μmol/L和88.6 μmol/L.     

雄性特异性噬菌体

雄性特异性噬菌体可分为DNA型和RNA型两大类。DNA型噬菌体粒体为细长丝状,衣壳由管状疏水蛋白质和导向蛋白质构成。疏水蛋白属于α—螺旋结构。病毒衣壳包被着一个共价闭合的单股环状DNA分子,分子量约为1.5——2×10~6道尔顿。所有RNA噬菌体都是雄性特异性的,病毒粒体为正二十面体。RNA噬菌体只含三个基因,只能编码三个可识别的蛋白质。它们的基因组及其三种蛋白质的一级结构都已测定清楚。RNA基因组作为模板,既能控制复制,又可起mRNA的作用,以指导翻译,在发育过程中呈现出特有的独特性。     

需氧恶性杆菌和海栖热袍菌基因组中第珠ATG规则的检验

将第一AGT规则用于需氧恶性杆菌（A.pernix)和海栖热袍菌（T.maritima)两类细菌基因组中，用已知的ORF（包含已知基因编码区）进行检验，其结果对以ATG起始的ORF序列，正确率分别为100％，89．9％，并对两种细菌基因组中L－Ter第一ATG之间的距离作了相应的统计分析，结果表明，非ATG起始的ORF中，L－Ter第一ATG之间的平均距离是以ATG起始的4至5倍，很可能是非ATG起始的ORF的一个重要序列特征，分析了两种细菌终止密码在L－Ter和Ter中的使用频率，发现在Ter中终止密码子使用的偏置程度比在L－Ter中大。     

污水处理系统中噬菌体的浓缩分离和宏合格基因组DNA的提取

以城市污水活性污泥为材料,经分级粗滤、超滤、等密度梯度离心等方法获得高纯度噬菌体悬液,常规SDS方法提取噬菌体DNA.荧光显微镜观察和计数表明浓缩液中噬菌体的纯度和丰度都显著提高;利用透射电镜对浓缩液进行观察,噬菌体的形态呈杆状、线状等多样;基因组提取结果显示,得到的DNA样品纯度高,大小介于20~25kb之间,电泳条带清晰,整个泳道没有弥散现象;利用细菌通用引物对提取的噬菌体DNA进行16SrDNA扩增阴性,说明所得到的噬菌体纯度较高,没有细菌污染.通过实验获得一种高效快捷的从污水处理系统中纯化浓缩噬菌体并进一步获得噬菌体宏基因组DNA的方法,同时为研究环境噬菌体生态分布、多样性组成奠定基础.     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先, 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次, 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后, 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先， 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次， 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后， 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因组细菌双杂交系统的构建

细菌双杂交系统是新近建立的一种研究蛋白质间相互作用的方法.应用细菌双杂交系统,分别以pBT、pTRG诱饵质粒构建编码WSSV基因组DNA随机片段的融合表达质粒pBT-wssv、pTRG-wssv.重组质粒共转化双杂交报告菌株XLl-Blue MRF′,通过LB-TCK平板筛选对虾白斑综合征病毒中有相互作用的蛋白质.本研究中我们构建了WSSV基因组细菌双杂交系统,用于筛选WSSV中有相互作用的蛋白,为该病毒功能基因组的研究打下良好的基础.     

野生型及突变型HIV-1 LTR驱动的荧光素酶稳定表达细胞株的建立

HIV潜伏感染是造成抗病毒疗法无法根除病人体内病毒的主要原因.建立有效的药物筛选模型,是成功筛选高效、低毒性HIV潜伏激活剂的关键.本研究中,我们构建了野生型及κB和TAR顺式元件突变型HIV-1LTR驱动的荧光素酶表达载体,并通过质粒转染人胚肾293细胞,通过G418筛选,获得了稳定表达的细胞克隆.从每个克隆中抽提基因组DNA,进行PCR扩增和序列分析,结果显示:报告载体稳定整合在细胞基因组中.进一步通过TNF-α去处理这些细胞模型,结果显示:10ng/mL TNF-α可以有效地激活野生型LTR和ΔTARLTR细胞,对ΔκB LTR细胞中荧光素酶表达水平没有影响.激活效果还在同一细胞的不同细胞克隆中得到了重复验证.     

AcMNPV bro基因的表达和作用研究

bro基因(baculovirus repeated orf)是杆状病毒编码的一个独特的基因家族,一些病毒的基因组中编码有多个该基因家族的成员.研究分析了苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组仅有的一个bro基因,结果表明:AcMNPVbro基因(ac-bro)在感染后6h就开始转录,并在8h时检测到BRO表达;ac-bro基因敲除的重组病毒感染后子代病毒的效价略低于野生型病毒,且其DNA复制明显推迟.利用大肠杆菌中重组表达的Ac-BRO蛋白进行的体外实验提示其具有结合DNA的能力.这些结果提示ac-bro基因在病毒的复制中有一定的作用.     

对虾白斑综合征病毒结构蛋白基因vp95表达时序分析及其抗体的制备

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是造成养殖对虾病害的主要病原,其300kb的双链环状DNA基因组共编码532个开放阅读框(open reading frames,ORF).蛋白VP95是WSSV的结构蛋白,在病毒囊膜蛋白和核衣壳中均有分布,由ORF wsv442编码,基因全长2 400bp.首先对基因vp95的表达时序进行分析,证明该基因属于晚期基因.为了更深入地研究该结构蛋白的功能,选择中间编码200个氨基酸的片段(1 051~1 650nt)进行克隆表达.此片段被克隆到pET-His载体上,构建好的质粒转化入表达菌株大肠杆菌(Escherichia coli)BL-21(DE3),经IPTG诱导后,收集细菌,超声破碎后,将含有可溶性表达重组蛋白的上清用Ni 2+-NTA agaros纯化.纯化的重组蛋白HisVP95-M200免疫小鼠,制备抗血清.为了去除血清中的杂质,用HiTrap NHS-activated HP(GE Healthcare)亲和层析纯化柱子纯化血清中抗蛋白VP95的抗体.Western blot分析显示,未纯化的血清和纯化的抗体对病毒粒子中蛋白VP95都有很高的效价,并且具有严格的专一性.为进一步研究VP95蛋白在病毒粒子的包装中的作用,以及其在病毒的入侵过程中的功能奠定了良好的基础.     

58型HPV E6蛋白的原核表达与分离纯化

宫颈癌是一种在女性人群中的常见肿瘤,严重威胁着女性的生理和心理健康;而人类乳头瘤状病毒(HPV)的长期感染是宫颈癌发生的主要诱因.因此,HPV病毒的研究对于我们了解和防治宫颈癌有着十分积极的意义.目前,国外的研究比较多的针对于16型和18型的HPV病毒;但是对于我国比较常见的58型HPV病毒却研究甚少.所以,本试验依据实验室现有的表达纯化平台和噬菌体展示多肽筛选平台,设计并构建了HPV58 E6蛋白的原核表达体系,并对E6重组融合蛋白进行了诱导表达.通过对表达获得的包涵体蛋白进行反复的洗涤、亲和层析以及复性等纯化步骤,得到了纯度较高的E6融合蛋白.     

CGSIV病毒ORF22R序列分析,克隆及大肠杆菌表达

中国大鲵虹彩病毒是近年来造成驯养大鲵大规模的发病及死亡的病原体之一.以病毒基因组为模板,分离了ORF22R DNA序列.蛋白氨基酸序列信息分析结果表明中国大鲵虹彩病毒与蛙病毒属中类两栖类蛙病毒组的成员有很高的同源性,达到95.9%~98.2%;而与蛙病毒属类GIV病毒组成员的同源性相对较低,为31.7%;与淋巴囊肿病毒属的成员的同源性最低,只有16%左右.将PCR技术分离的ORF22R DNA序列克隆至原核表达质粒pET22b.重组质粒pET22b-ORF22R转化于Rosetta大肠杆菌菌,经IPTG诱导,表达重组蛋白.镍柱纯化后SDSPAGE检测ORF22R蛋白分子量为65 kD,CGSIV ORF22R蛋白原核表达成功.     

λ噬菌体切除酶基因Xis在大肠杆菌中的可溶性融合表达

λ噬菌体切除酶Xis(excisionase)是调控λ噬菌体溶源裂解转换过程中的一种重要蛋白质.通过密码子优化及两步法将来自λ噬菌体切除酶基因Xis在体外合成,然后克隆到带有类泛素蛋白SUMO标签的定向原核表达载体SUMO-p ETG上,测序正确后,然后转化至E.coli BL21(DE3)细胞可溶性表达.经SDS-PAGE及质谱检测证实表达蛋白确实为目的蛋白.该研究通过融合表达λ噬菌体切除酶Xis不仅解除了Xis对E.coli宿主细胞的毒害作用,而且实现在E.coli中的高水平可溶性表达.因此,Xis的大量制备,将会促进Gateway克隆技术的广泛应用.     

一种蛙病毒的纯化和酶切分析

从患病虎纹蛙（Rana tigrina rugulosa)蝌蚪中分离得到一种蛙病毒,感染鱼的FHM、CO、EPC细胞,获得大量的病毒原料,分离纯化得到高纯度的病毒粒子,电镜下可见病毒粒子为二十面体,具囊膜,直径平均为125nm。抽提病毒核酸,对其基因组DNA进行酶切分析,病毒基因组为双链DNA分子,表现脊椎动物虹彩病毒基因组的特点即其胞嘧啶5′端高度甲基化。以限制性内切酶XbaⅠ、BanHⅠ、HindⅢ、KpnⅠ和PstⅠ酶切病毒基因组DNA,经电泳分离后,分别得到13、25、6、14、22条清晰的酶切片段,并根据酶切片段算得基因组的大小超过100kb。用PCR方法,得到这个病毒的主衣壳蛋白（MCP）基因保守序列,与FV3相比,同源性达98％。     

痘病毒F10L基因的克隆及生物信息学分析

将古浪山羊痘病毒的基因组DNA提取出来,并设计引物进行PCR扩增,克隆F10L基因的DNA序列.为了分析山羊痘病毒F10蛋白的分子特征,将PCR产物连接到p GEM-T Easy载体后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行序列测定,利用生物信息学软件对F10L基因序列进行预测分析.结果显示,F10L基因序列由1 335个核苷酸组成的开放阅读框,编码444个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量的理论值53.01 ku,理论等电点为7.14.该蛋白的二级结构中,α螺旋占12.44%,β折叠占15.73%,其余71.83%为无规则卷曲.多序列比对分析显示,不同羊痘病毒分离株F10L序列高度保守,一致性在97%以上.此研究结果为进一步研究F10蛋白的生物学功能和羊痘病毒早期蛋白的分子相互作用奠定了基础.     

HL—60细胞系基因组文库的构建

从培养的HL-60细胞中提取出高分子量的基因组DNA,以EcoRⅠ部分酶解,蔗糖密度梯度离心得到15～30kb的插入片段。以PEG8000沉淀,CsCl密度梯度离心提纯EMBL4噬菌体DNA,以EcoRⅠ,EamHⅠ双酶解得到左右臂,连接、包装得到9.7×10~5个重组体.随机检测了4个重组体,其插入片段平均为19kb.对于19kb的插入段,特定DNA序列达到99％检出率所需的重组体为7.3×10~5(Pfu).     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

糯米酒发酵过程中微生物基因组提取方法比较

为了更加快速地获得糯米酒发酵过程中高质量的微生物基因组DNA,本实验通过测定基因组DNA浓度和进行聚合酶链式反应(PCR),利用溶菌酶-SDS-蛋白酶-K(A法),改良CTAB(B法)和改良CTAB-溶菌酶(C法)三种实验方法获得微生物基因组DNA,通过比较三种方法发现,C法提取效率最高,获得的基因组DNA浓度为1 573.97±711.51ng/μL;B法获得的基因组浓度为1 436.03±128.0ng/μL;A法效率最低,获得基因组浓度为411.67±133.29ng/μL.以基因组DNA为模板进行PCR,将扩增产物在0.6%琼脂糖凝胶中进行电泳检验.结果显示C法获得的条带最清楚明亮,表明DNA浓度最高、结构完整.基因组DNA浓度和PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带的亮度表明,提取糯米酒发酵过程中微生物基因组DNA的最优方法为改良CTAB-溶菌酶法(C法).     

水稻16kDa醇溶蛋白启动子克隆及载体构建

水稻种子16 kDa醇溶蛋白是水稻种子成熟过程中,由16 kDa基因编码,16 kDa醇溶蛋白启动子调控,在胚乳中特异表达的蛋白质.以水稻基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到16 kDa启动子片段,序列分析结果表明:获得的启动子片段的大小为931 bp,与已报道的该启动子序列相比较,其核苷酸序列同源性为99.9%.该启动子区域含有TATA-box,CAAT-box,GCN4基序,Prolamin-box等胚乳特异表达启动子所必需的正调控元件.利用该启动子构建了植物种子特异表达载体pC16 kDP.