转APX基因烟草抗旱能力研究

用毛白杨中克隆得到的抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因,构建植物表达载体pBI121-APX,将pBI121-APX载体用农杆菌介导法转化烟草,成功得到转基因烟.PCR、PCR-Southern的结果表明,APX基因已经成功的整合到转基因烟草基因组中.干旱实验结果表明,与对照相比较,转基因烟草表现出较强的抗旱性.     

抗汉坦病毒单链抗体双元载体的构建

利用PCR方法,从含有1A8 scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因,并使基因两端携带合适的限制性酶切位点。经多步连接将其克隆入植物表达载体pBI121或pCAMBIA1305．2。酶切结果证明1A8 scFv基因被成功克隆入植物表达载体pBI121及pCAMBIA1305．2,构建获得1A8 scFv-p BI121及1A8 scFv pCAMBI A1305．2重组质粒,并将其转入农杆菌GV3101。抗汉坦病毒mAb 1A 8scFv植物双元表达载体的获得,为进一步在植物中表达该抗体片段奠定了基础。     

布鲁菌保护性抗原基因植物表达载体的构建

根据genbank序列,参照植物偏性密码子,设计合成适合植物表达的布鲁菌rplL基因和omp31基因。将携带植物表达优化序列的rplL基因片段与pBI-121载体相连接构建重组植物表达载体pBI121-rplL;将omp31基因与相应酶切并携带植物表达特征序列的pMD19-T6载体连接获得重组质粒,之后酶切获得携带植物表达优化序列的omp31基因片段,将其克隆入pBI-121载体,从而构建出带有不同目的片段的重组植物表达载体,为下一步检测基因在植物中的表达奠定基础。     

抗汉滩病毒单抗3G1 scFv植物表达载体的构建

利用PCR方法，从含有3G1 scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因，并使基因两端携带合适的限制性酶切位点．将其克隆人植物表达载体pBI121，构建获得3G1 scFv-pBI121重组质粒．酶切鉴定及测序结果均证明重组质粒构建成功，将重组植物表达载体转入农杆菌LBA4404，为进一步构建转基因植物的研究奠定了基础．     

磷酸甘露糖异构酶基因的克隆与表达载体的构建

根据genebank中公布的pmi基因序列通过PCR的方法从大肠杆菌中得到目的片断,并与pGM-T easy载体连接.将鉴定为阳性重组子中的目的基因进一步与植物表达载体pBI121的不同区域连接,成功构建了载体NPTII-pmi-121和pmi-121^△NPTII.     

AGO1基因对拟南芥叶边缘锯齿状发育的影响

在拟南芥和水稻中Argonaute(AGO)蛋白是RNA介导的沉默复合体(RISC)的核心组分,在植物叶极性的分化方面具有重要的调节作用。实验根据AGO1基因序列设计一对特异引物,提取野生型拟南芥RNA作为模板,采用反转录PCR方法扩增出AGO1基因,并插入到克隆载体pGEM-T中。筛选鉴定后将AGO1连接到植物表达载体pBI121上,构建起植物表达载体pBI121-AGO1。并且利用农杆菌介导的方法转化拟南芥,通过抗性筛选,获得转基因植株。然后对转基因植株进行表型分析及AGO1蛋白的RT-PCR检测。通过对转基因拟南芥表达分析发现,与野生型拟南芥相比超表达AGO1蛋白的转基因拟南芥叶片明显呈锯齿状,说明AGO1基因影响拟南芥叶片发育。     

灯盏花CHI基因的再克隆及其绿色荧光蛋白表达载体构建

根据灯盏花转录组所注释的CHI unigene片段,设计了RACE相关引物,克隆到灯盏花CHI的cDNA全长序列,序列全长717bp,编码238个氨基酸.该氨基酸序列与我们前期所克隆的灯盏花CHI cDNA序列相比,在345、351位点发生了突变,碱基均由C突变为T,两个位点的突变均属于同义突变,编码的氨基酸分别为115、117位异亮氨酸、酪氨酸.同时将CHI基因片段插入到pDM 18-T,构建pDM 18-T-eBCHI中间载体.经测序验证后,根据pBI121-EGFP图谱,设计带有SalI、SpeI酶切位点的引物,以pDM 18-T-eBCHI中间载体为模板,扩增带酶切位点的CHI序列,扩增产物经回收、纯化后与双酶切的pBI121-EGFP链接,构建了重组表达载体pBI121-EGFP-CHI,CHI基因插入植物表达载体pBI121-EGFP的6xHis组氨酸标签与GFP基因间.经SalI、SpeI双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750bp的目的片段,通过进一步测序证明,CHI基因已成功地连接到pBI121-EGFP-eBCHI中.采用电击转化法将重组质粒导入根癌农杆菌GV3101,用叶盘法转化灯盏花叶片,筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和叶绿素荧光成像检测证明,重组基因已成功地转化到灯盏花愈伤组织中.为利用转基因技术研究CHI基因的表达及其亚细胞定位打下基础.     

含有MAR序列的植物表达载体pBI121-MARs的构建

将MAR（Matrix Attachment Region）构建到外源基因表达框的两侧．可以促进外源基因的表达．减少转基因沉默。实验利用PCR方法从普通烟草基因组中分离到一段MAR序列，将其正向重复插入到植物表达载体pBI121肛葡糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因表达框的两侧，形成一个新的植物表达载体。     

甜味蛋白thaumatin表达载体的构建

将克隆在不同质粒上的thaumatin基因的两个片段连接起来，连接产物克隆到质粒pUC18上．测序结果表明，连接产物是一个完整的thaumatin cDNA基因．将此基因通过基因重组技术，克隆到植物表达载体pBI121中，构建了一个新的转化植物的表达载体-pBIl21-tha.     

异戊烯基转移酶基因克隆及植物表达载体构建

根据已知的异戊烯基转移酶基因保守序列设计引物,以根癌农杆菌C58的Ti质粒为模板,采用PCR方法扩增获得了异戊烯基转移酶基因723bp的片段.将该片段回收,连接到pMD18-T载体测序,测序片段经酶切回收后克隆到植物表达载体pBI121中,转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α.将阳性质粒转化农杆菌感受态细胞EHA105,经菌液和质粒PCR分析,获得了真核表达载体pBI121-ipt,这为异戊烯基转移酶基因功能的进一步研究提供了基础.