坛紫菜UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(Phugp)的克隆及表达分析

UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)是红藻琼胶生物合成过程中的关键限速酶。以坛紫菜(Pyropia haitanensis)转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE技术克隆获得了坛紫菜编码UGPase的基因序列:Phugp。序列分析结果表明:Phugp基因序列全长1734 bp,包含一个1530 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含510个氨基酸,相对分子质量为56.190 ku,等电点为6.24,具有UGPase特有的底物结合位点和红藻UGPase保守的N端和C端多肽结合位点。基因表达水平的定量分析结果表明:在不同程度的高温和高光胁迫条件下,Phugp基因的表达水平均极显著下调,而在不同程度的失水胁迫条件下,Phugp基因的表达则呈现为逐渐上调的趋势,说明Phugp基因在坛紫菜遭受不同的胁迫条件时呈现为不同的表达模式,并可能在应答失水胁迫中发挥着应激调节作用。     

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因调控不同地源灵芝孢子粉次生代谢产物的差异

目的 探讨不同地源灵芝孢子粉携带尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)基因在转录水平上的差异表达,以及对灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide,GLP)含量的影响.方法 采集不同地源灵芝孢子粉共7批18份,通过水浸煮-醇沉法提取GLP,应用苯酚-硫酸法计算GLP含量.克隆、测序UGPase基因,荧光定量PCR检测UGPase-mRNA.结果 灵芝孢子粉GLP检测结果显示:吉林产含量为(3.3610±0.0046)％,云南产含量为(2.8870±0.0059)％,××堂孢子粉含量为(2.3990±0.0053)％,差异具有统计学意义(P<0.05);克隆UGPase基因测序结果显示:不同地域灵芝孢子粉携带UGPase基因序列相同,与Genbank中UGPase基因序列(Sequence:KM260167.1)核苷酸同源性达100％.UGPase-mRNA检测结果显示:吉林产灵芝孢子粉为表达量最高.结论 不同地源灵芝孢子粉GLP与UGPase-mRNA相对表达量存在差异.UGPase基因在高多糖灵芝菌株中存在明显的表达优势,与GLP的生物合成呈正相关,该机制为深入研究GLP的生物合成提供了理论依据.     

甘蔗果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶基因的cDNA克隆及序列分析

以高等植物玉米、水稻的果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶(F2KP)的保守区域设计引物,并采用逆转录--聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从甘蔗叶片中扩增F2KP的cDNA片段,命名为SoF2KP-L.该cDNA片段长2 178 bp,含2 085 bp的完整开放阅读框,编码 694个氨基酸.序列分析表明,甘蔗F2KP与其它已知的高等植物F2KP具有很高的同源性.     

甘蔗抗坏血酸过氧化物酶的电子克隆及生物信息学分析

电子克隆是随着EST计划和生物信息学发展起来的基因克隆策略。运用电子克隆的方法获得甘蔗S-APX2基因。以水稻中一个基因OsAPX2为种子序列,对甘蔗的EST数据库进行搜索,应用相关软件进行预测和分析。获得一个甘蔗APX基因S-APX2的cDNA序列全长,该序列长1110bp,包含一个完整的975bp的ORF,编码324个氨基酸;属于疏水性蛋白,编码蛋白含有Heme binding site,Substrate binding site,K+binding site,Ascorbate-peroxidase结合位点和保守域,属于Plant-peroxidase-like Superfamily家族;亚细胞定位分析显示,编码蛋白位于植物细胞的线粒体中。具有5个丝氨酸磷酸化位点,9个苏氨酸磷酸化位点以及1个酪氨酸磷酸化位点;存在信号肽但是无跨膜结构域,二级结构由30.74%α螺旋、13.92%延伸链和40%无规则卷曲组成;且与水稻、玉米等其他植物的APX具有高度的同源性。电子克隆获得了完整的甘蔗APX基因全长cDNA。     

水液相下赖氨酸钙(II)配合物旋光异构的DFT研究

该文采用DFT的M06-2X和MN15方法结合极化介质的SMD模型,研究了在水液相下两性赖氨酸分子2价钙配合物(Lys·Ca(II))的旋光异构.反应通道研究发现:Lys·Ca(II)的旋光异构可在Lys从两性异构为中性后,α-H以氨基N作桥和羰基O作桥迁移的2个通道上实现.势能面计算结果表明:,α-H以氨基N作桥的反应通道最具优势,在隐性水溶剂效应下决速步能垒为220.8 kJ·mol^-1,α-H从手性C向氨基N迁移的过渡态在显性水溶剂效应下的能垒降至120.5 kJ·mol^-1左右.研究结果表明:在水液相下手性Lys·Ca(II)的消旋过程十分缓慢,其用于生命体同补Lys和Ca(II)具有较好的安全性.     

甘蔗SPSⅢ内含子地高辛探针的制备及检测

以甘蔗SPS基因选择性剪接保留的内含子6,7,8片段为靶序列,利用PCR扩增技术分别制备出3种地高辛标记的SPS内含子探针:SPS-intron 6探针167 bp,SPS-intron 7探针93 bp和SPS-intron8探针175 bp,并通过斑点杂交实验表明这3种探针灵敏度高,都能检测到pg级的靶核酸,且特异性好,阴性对照实验显示无杂交信号.     

文昌鱼碱性磷酸酶赖氨酸基团的研究

关于文昌鱼碱性磷酸酶(AKP)的基本性质及功能基团等,本实验室作了系统的研究,判定1个色氨酸残基为酶活性中心所必需,赖氨酸残基(Lys)是AKP活性必需基团之一,而每分子AKP上含有36个Lys。在此基础上,采用化学修饰剂对Lys基团进行定量研究,并探讨其它功能基团的性质,为酶的结构与功能关系提供进一步的信息。     

甘蔗组织培养中不同阶段的抗生素及PPT抗性筛选试验

本试验在甘蔗高效再生体系的基础上,在心叶愈伤组织诱导、胚性愈伤组织芽分化、生长以及生根各阶段的培养基中,分别附加不同质量浓度的G418、潮霉素(Hyg)和除草剂PPT3种选择性试剂,以确定甘蔗遗传转化所用的最佳筛选浓度.试验表明:福农81-745(糖蔗)与Badila(果蔗)2个品种对G418、Hyg和PPT的抗性差异不大;G418、潮霉素和PPT在甘蔗组培各个阶段均对外植体有强烈的抑制作用.因此建议在甘蔗遗传转化中,G418和Hyg对甘蔗愈伤组织诱导生长,芽分化、生长及试管苗生根3个阶段的抗性筛选质量浓度均为30mg·L-1;PPT对愈伤诱导生长和芽分化、生长2个阶段的抗性筛选质量浓度为0.75mg·L-1,而生根阶段为1.00mg·L-1.     

香菇UGPase酶活性及转录表达水平对不同碳氮源的响应

【目的】尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 (UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)是糖代谢途径中的关键酶,在生物体次生代谢产物合成过程中具有重要的作用,对其进行深入的研究,将有助于阐明糖代谢的分子机制。【方法】本实验以香菇新808为实验材料,设置不同的碳、氮源对香菇菌丝体进行液体发酵培养（25 °C,30天）,烘干菌丝体称取其生物量,利用苯酚-硫酸法测定菌丝体胞内多糖含量,通过荧光实时定量PCR检测不同碳氮源下菌丝体ugp基因的相对表达量,同时测定UGPase酶活性。【结果】结果表明,与普通PDA培养基比较,除以硝酸铵为氮源外,其余碳氮源均能提高香菇菌丝体生物量,其中以麦麸为碳源的生物量最大（0.63g）。以小分子糖（蔗糖、麦芽糖和甘露糖）为碳源、有机复合物（麦麸和黄豆芽）为氮源时,ugp基因表达量明显上调,UGPase酶活性更高,同时,其香菇菌丝胞内多糖的含量也更高。其中分别以蔗糖为碳源,以麦麸作为氮源时,ugp基因表达量、UGPase酶活性（分别为4043.80U/mg和3873U/mg）和菌丝胞内多糖含量（分别为3.60%和3.86%）最高,ugp基因表达量分别为对照组的8.19倍和6.52倍。【结论】香菇菌丝ugp基因转录表达水平、UGPase酶活性以及菌丝胞内多糖含量三者之间显示出较高的正相关性。小分子碳源（蔗糖、麦芽糖和甘露糖）、有机氮源（麦麸和黄豆芽）有助于香菇菌丝多糖的合成,其中蔗糖和麦麸可作为香菇液体发酵优势碳源和氮源。     

利用改良Nest-tetra-primer specific PCR技术对两种石斑鱼的鉴别

云纹石斑鱼(Epinephelus moara)和褐石斑鱼(E.bruneus)为石斑鱼属内近缘种,外形相似常被混淆.本研究改良建立了Nest-tetra-primer specific PCR方法,获得了云纹石斑鱼和褐石斑鱼线粒体DNA ND2基因内的3个特异性条带,分别为内参序列NC1(394 bp)、特异性条带ND2-M(268 bp)和ND2-B(122 bp),以及核基因组中核糖体DNA ITS1区的5个特异性条带,分别为内参序列NC2(588 bp)、NC3(563 bp),特异性条带rDNA-M(426 bp)、ITS1-M(488 bp)和ITS1-B(304 bp).研究结果不仅为两种石斑鱼的鉴别提供了稳定、可靠、快捷的特异性分子标记,而且也为鱼类近缘种的DNA鉴别提供了新的途径.     

中国对虾抗菌肽成熟肽的cDNA克隆

利用RT－PCR、嵌套PCR（Nested PCR)和3’－RACE等方法，从中国对虾血细胞中克隆到1种抗菌肽基因片段，称为中国对虾肽（Chp）基因。此基因片段长543bp，开读框共有156个碱基，编码52个氨基酸。该基因所编码的氨基酸序列对应于凡那对虾抗菌肽成熟肽的序列，与其一致性为52－59％，相似性为61－73％，分子量为5652．4Da，理论等电点为9．76，带正点荷的氨基酸（Arg-Lys）为8个，不含带负电荷的氨基酸。上述这些特征（分子量较小，带正点荷）均为抗菌肽的普遍特征。     

苏云金芽孢杆菌猝倒亚种Cry1Aa13基因的克隆及序列分析

根据Gen Bank中Cry1A类基因序列设计一对特异性引物，以苏云金芽孢杆茵猝倒亚种质粒DNA为模板，应用PCR扩增技术得到一大小约为3．6kb的DNA片段(Cry1Aa13)．通过引物步行法测定该片段长3598bp，其中开放阅读框(ORF)长3540bp，编码1180个氨基酸，分子量为133．49kD，等电点pI=5．0．序列比较表明该基因与Cry1Aa类基因高度同源(达95％以上)，该基因已在GenBank中登录，登录号为AF510713，并被Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为Cry1Aa13。     

中华绒螯蟹卵巢新基因EJO5的全长cDNA克隆和序列分析

利用RACE技术从中华绒螯蟹卵巢获得了新基因EJO5 (Eriocheirjaponicaovarygene 5 ,EJO5 )的全长cD NA序列 (GenBank检索号 :AY185 92 1) .该cDNA序列长度为 14 2 5bp ,开放阅读框为 5 85bp ,编码 194个氨基酸 .根据氨基酸序列计算的相对分子质量和等电点分别为 2 2 3 44和 9 5 .用生物信息学的方法未能得到对该基因功能预测的信息 .     

猪Klf4、Klf5和Egr2基因内含子的克隆及进化分析

从猪肝脏提取基因组作为模板,分别扩增了Klf4、Klf5和Egr2的第3、第2和第1内含子,长度分别为916、1027和1342bp,并通过其两端连接的部分外显子序列与Genbank序列比对加以确认,并和人相应基因内含子作长度和序列同源性比较。结果表明,由内含子比对得出的这些基因在人和猪间的保守程度与这些基因在氨基酸水平上比对得出的保守程度相一致。     

牛ANGPTL1基因的电子克隆与序列分析

以牛的ANGPTL1基因为研究对象,利用生物信息学方法,对牛的ANGPTL1基因进行了电子克隆和序列分析,并对推导出的ANGPTL1蛋白结构与性质进行了初步分析。结果表明,牛的ANGPTL1基因序列长为2576bp,该基因的编码序列长为1476bp,编码492个氨基酸,编码序列的两翼有135bp的5’非编码区和785bp的3’非编码区。DNA序列的G＋C百分含量为44．31％,A＋T百分含量为55．69％。该基因的核苷酸序列与人、黑猩猩、鼠和狗ANGPTL1基因的cDNA序列的相似性分别为91％、90％、82％和93％。在氨基酸序列上与人、黑猩猩、鼠和狗的相似性分别为95％、95％、92％和95％。用氨基酸序列构建的进化树显示,在人、牛、黑猩猩、狗、褐鼠、原鸡几种动物中,牛与狗的亲缘关系最近。     

新疆小拟南芥ApCBF1基因的克隆及其过量表达转基因的研究

利用同源克隆法,克隆了小拟南芥的CBF1基因的cDNA（FJ491244）,比对分析结果表明,ApCBF1的cDNA序列的A252,在拟南芥的AtCBF1的cDNA是T252,但翻译的氨基酸均是Ala,表明ApCBF1和AtCBF1翻译的氨基酸序列完全一致。构建了过量表达载体：p35S：ApCBF1,通过花滴法转入小拟南芥中。RT-PCR检测结果表明,转基因T0代AtCBF1基因过量表达。     

猪Akt1、Akt2基因克隆与组织表达图谱分析

为了得到长白猪蛋白激酶Akt1和Akt2基因序列并分析其表达模式,本研究使用RT-PCR方法,首先克隆了蛋白激酶Akt1和Akt2的cDNA.序列分析显示:长白猪Akt1基因的cDNA全长1461bp,编码具480个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠同源性达到97%以上.长白猪Akt2基因cDNA全长为1505bp,编码具481个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠的同源性高达97%以上.SMART分析表明,猪Akt1和Akt2蛋白均包含了与PI-3K结合的PH结构域及2个具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S_TKc结构域.RT-PCR检测结果显示:Akt1mRNA在垂体、心脏、肝脏、脾脏、肌肉组织中高表达,在大脑、小脑、肾脏表达丰度较低.Akt2则在小脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏和肌肉组织中高表达,而在大脑和肾脏中表达丰度较低.     

皱纹盘鲍Hdh-MMP-1基因cDNA的克隆及原核表达

利用同源克隆方法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肌肉组织中克隆得到基质金属蛋白酶-1基因(Hdh-MMP-1)cDNA全长序列(GenBank登录号:KR537291)。结果表明,Hdh-MMP-1 cDNA全长2136 bp,其中ORF长度为1551 bp,编码区含有516个氨基酸残基,预测其分子质量为58.94 ku,理论等电点为5.99。Hdh-MMP-1具有MMPs家族典型的N-端前肽区、催化区、铰链区和C-端类血红素结合区。利用SOPMA和SWISS-MODEL软件对该基因编码蛋白质高级结构进行了预测分析。氨基酸序列相似性结果显示,Hdh-MMP-1不仅与多种生物MMP-1基因具有序列相似性,且与某些软体动物和虫类的MMP-14及MMP-19也具有序列相似性。多序列比对结果显示,Hdh-MMP-1与红螺鲍、杂色鲍、美洲牡蛎的MMP-1相似性分别为95.29%、82.35%、38.85%。随后,构建了表达载体pET28a-catMMP-1,利用大肠杆菌原核表达系统,在大肠杆菌BL21 (DE3)中成功对该蛋白质催化区进行异源表达。     

亚洲一型口蹄疫病毒YNAs1.1株结构蛋白VP1基因的核苷酸序列分析

提取BHK21细胞增殖的亚洲一型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus Serotype Asial)强毒株YNAs1.1的RNA,用一对引物P7,P13经反转录（RT）－PCR法扩增了约674bp的DNA片段。克隆目的基因后,采用双脱氧DNA链末端终止法测得了YNAs1.1的VP1基因36－633核苷酸序列。分析表明,病毒VP1基因的核苷酸序列与以色列以及印度已报道的Asia1型FMDV的同源性分别为82.11%与88.07%,对应的氨基酸序列同源性为87.94％与93.47％。该序列在GeneBank登陆号为AF241566。