巴尔通体HBPC蛋白原核重组表达及抗原性研究

为了寻找可用于巴尔通体(Bartonella)检测的特异性抗原,利用PCR方法从巴尔通体厦门分离株(B.tribocorum_XM)的基因组DNA中扩增出血红素结合蛋白C(HBPC)蛋白基因,并将该基因的编码区克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,构建带GST标签的融合蛋白重组表达载体,并转化大肠杆菌(Escherichia coli DH5α),诱导表达GST-HBPC,通过亲和层析技术纯化GST-HBPC.最后运用蛋白质斑点印迹试验(Western blot)和间接ELISA法检验GST-HBPC是否具有抗原性.结果表明,所构建的表达载体可在大肠杆菌中大量表达GST-HBPC,Western blot和间接ELISA显示GST-HBPC能够特异性地与感染动物血液样本发生免疫反应.因此,体外重组的巴尔通体抗原蛋白HBPC可作为潜在的抗原用于巴尔通体血清学免疫检测.     

人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

Myostatin基因原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化与鉴定

应用基因工程技术,将合成Myostatin C-末端区(330bp)的基因序列,克隆至原核表达载体pQE30,以构建人的Myostatin基因原核表达载体.构建的重组质粒pQE-Ms转染大肠杆菌宿主菌DH5α后,IPTG诱导表达重组蛋白.应用SDS-PAGE电泳和Western Blot分析和鉴定了重组蛋白的特异性,并用镍离子亲和色谱柱层析进行目的蛋白的纯化与鉴定.结果表明:重组质粒pQE-Ms酶切和测序结果与预期相符,SDS-PAGE电泳和Western Blot证实表达蛋白为目的蛋白,蛋白表达形式为包涵体,经镍离子螯合亲和层析柱纯化及鉴定,确定实验获得了高纯度的目的蛋白,为人体血清中Myostatin蛋白表达的检测及特异性抗体制备等研究提供了实验依据.     

pPET-SUMF2各亚型的原核质粒构建及蛋白表达

构建人硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因各亚型的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达pPET-SUMF2各亚型的融合蛋白。用EcoRI和XhoI双酶切人SUMF2各种亚型基因及质粒pPET-30a;将2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌DH5α。挑取菌落培养,提取质粒进行验证。将构建成功的pPET-SUMF2各亚型重组表达质粒转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析以及Western blot检测SUMF2各亚型的融合蛋白表达。成功构建了pPET-SUMF2各亚型的重组表达质粒,并成功诱导SUMF2各亚型融合蛋白的表达,Western blot结果显示在预期位置有特异蛋白条带表达,并在BL21(DE3)内表达了SUMF2各亚型的融合蛋白,为进一步研究SUMF2的功能以及SUMF2与哮喘发病的关系奠定了基础。     

幽门螺杆菌粘附素基因的原核表达

目的：构建幽门螺杆菌粘附素（hpaA）基因的原核表达载体，并诱导表达。方法：用PCR扩增hpaA目的基因片段，克隆至pQE-30表达载体中，构建含目的基因的表达质粒pQE-hpaA，转化E．coli DH5α，经IPTG诱导表达蛋白HpaA；Western blot分析其免疫反应性。结果：经测序hpaA基因片段由783bp组成，可编码260氨基酸残基的多肽。经SDS—PAGE分析相对分子量（Mr）约为30000。可溶性表达占全菌的42％以上。Western blot分析能与Hp全菌抗血清反应。结论：成功构建了粘附素hpaA基因的原核表达载体并能高效表达，为研制Hp疫苗提供理论依据。     

豌豆胰岛素基因克隆、表达及融合蛋白纯化

将人工合成的豌豆胰岛素(PAlb)基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到PA1b基因,将此基因克隆到原核表达载体pMAL-p2x中,然后将重组质粒pMA1-p2X-PA1b转化大肠杆菌DH5a,经IPTG诱导进行可溶性表达．以Amylose Resin亲和层析,纯化出融合蛋白MBP-PA1b．经SDS-PAGE及Western印迹证明,融合蛋白MBP-PA1b在大肠杆菌中表达成功,为深入研究PA1b的功能作了准备．     

SARS病毒E基因的克隆及原核表达

为了得到纯的SARS-CoV E蛋白以进一步研究其功能,通过Touch-down PCR程序,从SARS-CoV WHU cDNA(pMD18-T载体)文库中扩增了E基因,构建了重组质粒pGEX-E,并在Ecoli DH5α中进行了原核表达。SDS/PAGE及Western blot结果表明SARS病毒E蛋白的分子量约5 kDa,较预测的略小,并进一步分析了这种现象产生的可能原因。     

原核系统表达的鸡白细胞介素-10的鼠抗血清体内研究的初步分析

目的获得鸡白介素-10(chIL-10)的原核表达产物,制备鼠抗血清,分析与真核系统表达的chIL-10的反应原性。方法采用RT-PCR从经脂多糖(LPS)体外刺激的鸡外周血淋巴细胞中扩增编码成熟IL-10的基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+),成功构建原核重组质粒pET-chIL-10;转化至大肠杆菌DH5α中IPTG诱导表达,切下含有重组蛋白的SDS-PAGE胶条,免疫制备鼠抗血清;分别与包含信号肽和去除信号肽的chIL-10真核表达细胞系CHO-euchIL-10F和CHO-euchIL-10M进行间接免疫荧光抗体试验(IFA)和蛋白免疫印迹试验(Western blot),验证有无反应性。结果成功构建chIL-10的原核表达载体pET-chIL-10,获得了高效价的鼠抗血清,能与表达chIL-10的真核细胞系反应。结论原核表达的chIL-10特异性鼠抗血清将能用于体内研究的检测。     

HIV-1外膜蛋白原核表达载体的构建与表达

为原核表达免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)外膜蛋白,对HIV-1外膜蛋白的基因进行了修饰,并利用PCR技术克隆env基因,将env基因克隆到原核表达载体中,利用大肠杆菌表达系统表达外膜蛋白,应用Western blotting检测其表达情况.结果表明:酶切鉴定证实正确地构建了pRSETB表达质粒,Western blotting和SDS-PAGE试验检测结果表明,构建后的env基因能在低温诱导的条件下表达.产物的相对分子质量为50000和33000,表达的env蛋白具有较好的免疫原性.     

布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶基因的原核表达与鉴定

对布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶(pgm)蛋白进行了表达与纯化,为研究该基因的功能提供了物质基础。首先利用PCR方法从羊种布鲁氏菌基因组DNA中PCR法扩增pgm基因,并将该基因亚克隆至pET-28a(+)载体中,转化入大肠杆菌(DE3),诱导表达融合蛋白;表达产物经Ni-NTA Agarose亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:扩增了pgm的全基因,成功构建了布鲁氏菌pgm基因的原核表达载体pET-28a(+)-pgm,并且在大肠杆菌中进行了表达,经Western blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,且具有良好的免疫反应性。本研究为进一步研究布鲁氏菌pgm蛋白的生物学功能提供基础物质,也为进一步开发基因工程疫苗提供理论基础。