人脐带间充质干细胞植入大鼠肝切模型中的分化研究

目的:探讨携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSC)植入肝部分切除大鼠体内后,其在大鼠肝脏中的分化能力。方法:首先将人脐带间充质干细胞分离培养并且进行表面标志物检测,以携带EGFP标记的慢病毒载体(lentiviral vector,LV)转染HUC-MSC。将SD大鼠随机分成3组:空白组、模型组及实验组,3组均建立大鼠肝切模型,空白组不注入HUC-MSC,模型组注入未标记的HUC-MSC,实验组注入EGFP标记的HUC-MSC。3个月后分离大鼠肝脏细胞,继而进行相关指标检测。冰冻切片HE染色观察病理结构,流式细胞仪检测间充质干细胞的纯度及CD90在肝细胞中的表达量,荧光显微镜观察EGFP在肝组织的表达。结果:病理切片显示带有EGFP的人脐带间充质干细胞在组织上表达,其中一部分聚集于血管内,形成栓子,附在血管壁上;手术后各组大鼠的肝都有炎症反应,但组织结构良好,各组间未见明显的形态学差异。HUC-MSC高表达CD44、CD29、CD105和CD90,不表达CD34、CD45、CD106、CD31、CD40和HLA-DR。流式结果显示模型组EGFP的表达率为(0.27±0.21)%,实验组为(11.68±1.46)%,与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。CD90的表达结果显示模型组CD90的表达量较高,为(0.843±0.146)%,实验组低表达CD90,阳性率为(0.026±0.017)%,与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。结论:人间充质干细胞可以分化为肝细胞,LV介导EGFP标记的人间充质干细胞可以稳定分化为肝细胞并且被检测到,但是易于形成栓子,肝细胞低表达CD90,为以后干细胞的分化提供实验依据。     

骨髓间充质干细胞向视网膜光感受器样细胞诱导分化探讨

目的:探讨体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)诱导分化成视网膜光感受器样细胞的能力。方法:用贴壁筛选法分离、培养SD大鼠骨髓MSC细胞,经流式细胞仪鉴定后,利用光感受器细胞培养上清液诱导MSC细胞14 d。用免疫细胞化学染色和Rt-PCR观察诱导后的细胞是否表达视紫红质(Rhodopsin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果:诱导细胞14d后即可见有神经元样细胞出现,实验组MSC的Rhodopsin表达率为35.1%±6.2%,而对照组中无Rhodopsin阳性的细胞,实验组MSC的NSE表达率为33.6%±4.0%,对照组为10.6%±5.0%,实验组MSC的GFAP表达率为9.6%±1.5%,对照组为13.7%±3.0%。RT-PCR鉴定结果分析示实验组MSC的GFAP、NSE、Rhodopsin mRNA均有表达,而对照组的只表达GFAP和NSE,未见Rhodopsin条带。结论:体外培养的rMSC,经过视网膜光感受器细胞培养上清液导,可以分化为视网膜光感受器样细胞。     

小鼠胎肝间充质干细胞体内向骨骼肌样细胞分化的研究

目的:了解小鼠胎肝间充质干细胞在体内向骨骼肌细胞分化的潜能。方法:无菌条件下将C57BL/6 J胎鼠肝脏制成单细胞悬液,雄性胎肝悬液体外贴壁培养纯化,传3代后将贴壁细胞移植于心肌毒素(card iotoxin)造成的雌鼠骨骼肌损伤部位,2月后处死受鼠,取相应骨骼肌组织固定、制片;用免疫组织化学染色和荧光原位杂交检测雌性受体小鼠骨骼肌组织内供体小鼠胎肝间充质干细胞向骨骼肌样细胞分化情况。结果:在骨骼肌组织内发现存在Y染色体阳性的供体来源的细胞,同时呈现骨骼肌组织的部分特征,表型为desm in /F lt-1-/CD4-5/F4-/80。结论:胎肝中分离出的间充质干细胞在体内可以分化为骨骼肌样细胞。     

骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的研究进展

摘要: 由各种因素导致的重症肝病的终末治疗的最好手段一直是原位肝移植,但长期以来肝供体的缺乏和免疫排斥引起的一系列问题极大地限制了该手术的运用,同时,在肝脏相关药物的筛选中,原代肝细胞难于培养且易在培养过程中变异,而随着骨髓间充质干细胞研究的深入,越来越多的证据表明骨髓间充质干细胞具有向肝细胞分化的潜能。因此,骨髓间充质干细胞诱导分化而成的肝样细胞在再生医疗和药物筛选领域具有较好的运用前景,本文就间充质干细胞的分离培养及其生物学特性,肝样细胞的诱导培养条件,生物学特性及其运用前景加以综述。     

人骨髓间充质干细胞诱导分化为RPE样细胞的探讨

目的:探索骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外定向分化成视网膜色素上皮(RPE)样细胞所需的微环境。方法:采用淋巴细胞分离液梯度离心法分离纯化BMSCs,第一阶段将培养第3代的细胞以bFGF、EGF及BDNF三种因子首先进行向神经前体细胞诱导分化,应用免疫细胞化学检测诱导细胞巢蛋白表达情况,当巢蛋白阳性表达率达到最高时去除诱导因子,进行第二阶段与第三代人RPE细胞共培养诱导2w,两阶段诱导后均采用免疫细胞化学及RT-PCR方法检测角蛋白及RPE65蛋白表达情况。结果:免疫细胞化学检测方面,诱导第3d开始能检测到巢蛋白表达,第12d阳性表达率达到最高,达(86.9±2.6)%,第一阶段诱导后见角蛋白表达,未见RPE65蛋白表达,第二阶段诱导后见角蛋白表达,阳性率为(60.8±3.1)%,见RPE65蛋白表达,阳性率为(25.7±3.8)%。RT-PCR检测方面,两阶段角蛋白与RPE65蛋白结果与免疫细胞化学检测结果一致。结论:体外采用分阶段诱导法,应用因子bFGF、EGF、BDNF及与RPE细胞共培养的微环境作用下能在体外诱导BMSCs表达RPE细胞标志物角蛋白以及RPE65蛋白。     

骨髓间充质干细胞向心肌分化的研究进展

目的:介绍骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究进展.方法:综合分析近年来国内外相关文献资料.结果:骨髓间充质干细胞在体内、外均可分化为心肌细胞.结论:骨髓间充质干细胞有望成为心衰干细胞移植治疗的理想细胞材料.     

骨髓间充质干细胞向神经元细胞诱导分化的研究进展

骨髓间充质干细胞（MSCs）具有多胚层分化特性,是干细胞治疗的重要种子细胞之一。目前,大量体外及体内分化实验表明,MSCs在特定的细胞因子、生长环境及培养时间等条件下可以向神经元细胞分化,表现在其能表达神经元特异标志,并显示出神经元细胞的某些功能;对其分化的机制探索也在逐渐深入。但对于分化的持久性、具体机制如何等问题仍有待进一步研究。     

当归诱导人脂肪间充质干细胞分化为神经元样细胞

研究当归体外定向诱导人脂肪间充质干细胞(AMSCs)分化的作用.自皮下脂肪组织获得梭形细胞,观察细胞生物学特征,免疫组化鉴定波形蛋白和CD44.AMSCs用25×10-6L/mL〖JP〗当归注射液预诱导24 h后,用100×10-6L/mL当归注射液不含血清的DMEM/F12进行诱导.光镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志.人脂肪组织中能够分离培养出生长旺盛的脂肪间充质干细胞,当归诱导24 h后,部分AMSCs转变为神经元样细胞,出现突起,免疫细胞化学染色NSE呈阳性、GFAP阴性.人脂肪间充质干细胞在体外可被当归诱导分化为神经元样细胞 .     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及分化潜能鉴定

用全骨髓贴壁法从SD大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)。为鉴定其成骨分化潜能,将大鼠BM-MSCs进行成骨诱导培养,第7天用碱性磷酸酶染色显示有碱性磷酸酶阳性细胞,第21天进行茜素红染色有矿化骨节形成。为鉴定其成脂分化潜能,将大鼠BM-MSCs先在成脂诱导培养基中培养,再换为在成脂肪维持培养基中培养,第10天进行油红O染色有脂滴形成。表明从SD大鼠骨髓中成功分离得到具有多向分化潜能的大鼠BM-MSCs,为其作为种子细胞应用于临床或研究奠定基础。     

脐带源间充质干细胞的生物学性状及其成脂肪细胞诱导分化

以健康产妇脐带为材料分离脐带间充质干细胞,体外培养扩增传代,做细胞形态观察,计数细胞并绘制细胞生长曲线,用流式细胞仪测定细胞周期以及免疫表型,测定细胞定向诱导分化成脂肪细胞的能力.发现人脐带源间充质干细胞能在体外培养扩增,可定向诱导分化为脂肪细胞并且具有和骨髓来源的间充质干细胞相似的生物学形态和抗原表型.成功建立了脐带源间充质干细胞系,可以作为干细胞研究和应用的新的材料来源.     

高糖诱导人脐血间充质干细胞向胰岛样细胞分化

目的:探讨脐血间充质干细胞向胰岛样细胞分化的潜能.方法:分离脐血有核细胞,将其置于MesencultTM培养基中进行培养,并利用贴壁法进行纯化、扩增.扩增后的脐血间充质干细胞用含体积分数5%胎牛血清的H-DMEM持续诱导.采用胰岛素免疫荧光染色对诱导后的细胞进行鉴定,定量检测胰岛素分泌水平及其对葡萄糖刺激的反应性.结果:诱导后,细胞形态发生明显变化,变圆而且聚集成团;细胞的胰岛素免疫荧光染色为阳性;而且细胞能分泌少量胰岛素,并对糖刺激具有反应性.结论:在高糖环境中,脐血间充质干细胞具有向胰岛样细胞分化的潜能.     

尼古丁对人脐带间充质干细胞氧化应激的影响

目的:研究尼古丁对人脐带间充质干细胞(HUCMSCs)超微结构及氧化应激的影响,探讨尼古丁诱导HUCMSCs凋亡的作用机制.方法:不同浓度尼古丁作用HUCMSCs后,透射电镜(TEM)观察HUCMSCs超微结构变化.分光光度计法检测HUCMSCs胞内过氧化氢酶(CAT)活性,黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性,化学比色法检测还原型谷胱甘肽(GSH)活性,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量.分光光度计法检测一氧化氮合酶(NOS)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)活性.结果:尼古丁作用HUCMSCs后,细胞内出现大量空泡状结构,粗面内质网扩张成池,线粒体嵴扩张.细胞内CAT、SOD、GSH活性均显著降低,脂质过氧化产物MDA含量显著增加,呈浓度依赖性.NOS、iNOS活性随尼古丁浓度上升而逐渐增加.结论:尼古丁可增加HUCMSCs的NOS、iNOS活性,使细胞发生凋亡结构改变,呈氧化应激状态,发生氧化-抗氧化系统失衡.     

人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定

目的:从人脐带中分离、培养并鉴定间充质干细胞(MSCs).方法:用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞,差速贴壁法进行纯化;MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;流式细胞仪检测其表面标志和细胞周期;地塞米松、抗坏血酸、磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶染色鉴定;地塞米松、胰岛素、吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,用油红O染色鉴定;将脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下,观察有无致瘤性.结果:从人脐带中分离出的同充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,低表达CD106,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能;将脐带MSCs移植到BALB/c裸鼠肾被膜下,未观察到致瘤性.结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞生物学特性.     

尼古丁诱导人脐带间充质干细胞凋亡的机制

目的:探讨尼古丁作用人脐带间充质干细胞(MSCs)前后,一氧化氮(NO)、细胞内钙离子(Ca2+)的变化及α7 nAchR的表达情况.方法:采用硝酸还原酶法检测不同质量浓度尼古丁作用于MSCs后24、36、48h,MSCs内NO的释放情况;尼古丁作用MSCs 24 h,fluo - 3/AM染色,流式细胞仪检测MSCs内Ca2+变化;用RT - qPCR检测尼古丁作用后α7 nAchR的表达情况.结果:尼古丁作用MSCs 24、36 h后,各实验组NO水平显著高于对照组(P＜0.05),呈时间、质量浓度依赖性,但在48 h,质量浓度0.8与1.0 mg/mL组,NO水平低于对照组.尼古丁作用后,各实验组质量浓度(0.6、0.8、1.0 mg/mL)的Ca2+荧光强度分别为( 141.26±16.01)、(164.90±18.39)、(198.76±17.63),均高于对照组(119.30±14.14),其中质量浓度0.8、1.0 mg/mL组与对照组相比有显著差异(P＜0.05).MSCs可表达α7 nAchR,且尼古丁作用后表达水平增高,呈时间浓度依赖性.结论:尼古丁可上调人脐带MSCs的α7nAchR表达,并通过刺激MSCs释放NO、升高细胞内Ca2+从而致MSCs凋亡.     

人脐血间充质干细胞移植治疗大鼠急性肝损伤

目的:探讨人脐血间充质干细胞对急性肝损伤大鼠模型的治疗作用.方法:体外培养人脐血间充质干细胞.60只SD大鼠随机分为3组,各20只:空白对照组、模型对照组、治疗+模型组.模型对照组大鼠采用体积分数50%四氯化碳橄榄油溶液腹腔注射造成急性肝损伤疾病模型,测定ALT/AST水平、肝脏切片HE染色评估造模效果.治疗+模型组大...     

人脐带间充质干细胞对小鼠衰老进程中骨髓细胞集落生成的影响

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)对小鼠衰老进程中骨髓造血干祖细胞增殖能力的影响.方法:由足月新生儿脐带分离间充质细胞(MSC)作供体,6月龄Balb/c小鼠为受体,将小鼠随机分为实验组和对照组,实验组输注MSC(5×10~5/只),每月1次,共4次;对照组输注生理盐水.干预开始后第3个月和第6个月分别比较两组的单侧股骨骨髓有核细胞计数(BMNC)、造血祖细胞集落培养(CFU-GM、CFU-E、CFU-MK)和外源性脾集落形成单位计数(CFU-S).结果:干预后第3个月时,实验组BMNC、CFU-GM和CFU-MK高于对照组,而CFU-E和CFU-S无明显差别;干预后第6个月时,实验组的上述指标均明显高于对照组,且随着衰老出现下降的速度明显慢于对照组,差异有显著性(P<0.05).结论:定期输注hUC-MSC可以相对增加宿主自身造血干祖细胞的生物学活性,从而延缓小鼠造血组织的自然衰老进程.     

脐血间充质干细胞在大鼠损伤肝脏迁徙途径的实验

目的:建立慢病毒载体转染增强型绿色荧光蛋白基因至人脐血间充质干细胞的实验体系,观察绿色荧光蛋白标记的人脐血间充质干细胞在急性肝坏死大鼠模型肝脏局部的迁徙途径.方法:采集新鲜人脐血,梯度离心及低血清培养基体外分离、培养人脐血间充质干细胞,以慢病毒为载体转染绿色荧光蛋白基因至人脐血间充质干细胞.CCl4橄榄油溶液腹腔注射建立急性肝坏死大鼠模型,将2.0～5.0×106绿色荧光蛋白标记的人脐血间充质干细胞肝脏局部移植给模型鼠,24、48、72 h、1周、2周和4周分别处死模型鼠,冰冻切片,荧光显微镜下观察移植细胞在肝脏局部的迁徙途径.结果:转染细胞荧光显微镜下呈现均一绿色荧光影像.细胞移植24 h内可见荧光信号由进针孔迁徙至汇管区,移植治疗48 h时移植细胞定居于汇管区,48 h后荧光信号向坏死病灶区域迁徙,1周后在肝脏坏死局部区域可见稳定的荧光信号.结论:本实验构建的绿色荧光蛋白转染人脐血间充质干细胞示踪体系稳定表达绿色荧光蛋白.经动物实验证明人脐血间充质干细胞肝脏局部移植给肝坏死大鼠模型后在肝脏局部经历了"进针孔至汇管区","汇管区至病灶区"的二次迁徙模式.     

In vitro differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells into endothelial-like cells

The neovascularization of ischemic tissue is a crucial initial step for the functional rehabilitation and wound healing. However, there is lack of a potential source of cells for the foundation of a vascular network. The re- cent studies indicate that hum…     

人足月胎盘间充质干细胞的分离纯化及其特征

目的:从人足月胎盘中分离、培养间充质干细胞(MSCs),并研究其生物学特征.方法:将人足月胎盘组织经胶原酶Ⅱ消化和贴壁培养法获取间充质干细胞,运用活细胞计数和碘化丙啶(PI)检测其增殖能力;采用流式细胞术检测其细胞表面标志的表达;用地塞米松、抗坏血酸及β-磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用Yon Kos-sa染色进行鉴定;用地塞米松与胰岛素诱导其向脂肪细胞分化,并以油红O染色进行鉴定.结果:从人足月胎盘分离的间充质干细胞为梭形贴壁细胞,增殖能力较强;强表达CD44、CD29,不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR;经诱导后向脂肪细胞及成骨细胞分化,油红O染色、Von Kossa染色为阳性.结论:人足月胎盘中也富含间充质干细胞,与其他来源的间充质干细胞的生物学特征相似,可能是组织工程新的干细胞来源.     

miRNA在人骨髓来源间充质干细胞成骨诱导分化过程中的表达

观察miRNAs在人骨髓来源间充质干细胞成骨诱导分化过程中的表达情况。以从骨髓中分离培养的MSCs及成骨诱导培养后的细胞为实验对象,利用基因芯片检测miRNAs的表达情况,由SAM分析得到MSCs较其诱导培养细胞中差异表达的miRNAs,再进行生物信息学分析。分离培养出的MSCs经成骨诱导培养14 d后,已具有成骨细胞特性;经芯片检测并SAM分析,成骨诱导培养的细胞较MSCs高表达的miRNAs有7个:hsa-miR-363*、hsa-miR-483、hsa-miR-590、hsa-miR-130a、hsa-miR-15b、hsa-miR-30c、hsa-miR-663;成骨诱导培养的细胞较MSCs低表达的miRNAs有6个:hsa-miR-192、hsa-miR-210、hsa-miR-128a、hsa-miR-224、hsa-miR-106a、hsa-miR-494。利用TargetScan预测其靶基因,并行生物信息学分析,其中hsa-miR-130a、hsa-miR-15b和hsa-miR-30c的预测靶基因多为维持干细胞特性的基因;而hsa-miR-106a和hsa-miR-494的预测靶基因多为参与骨形成及成骨分化的基因。为证明miRNAs参与调控MSCs的成骨分化过程提供了直接证据和研究基础。