高等植物基因的内含子

针对高等植物基因的内含子结构和功能的研究现状进行了评述,内含子是真核基因的一个重要组成部分,对其结构和功能的认识随着研究的深入而不断变化（或华）,高等植物基因内含子的结构特征既有保守性,又有差异,它的剪辑过程涉及诸多频式元件和反式因子之间的相互作用,如5′剪辑位点、3′剪辑位点以及各种蛋白质因子,高等植物基因内含子的剪辑过程是真核生物表达的一个重要环节,特别是内含子的可为剪能够调节基因的时空表达。另外,高等植物基因内含子序列在基因表达调控中也具有重要作用,如影响基因的表达模式、增强基因的表达水平和启动基因的表达等。     

分泌改善的重链促进基于蛋白内含子的双载体共转全长FVⅢ基因

在甲型血友病基因治疗中, 其疗效受FVⅢ的低分泌性和较大的FVⅢ基因难以为腺相关病毒(AAV)载体运载等因素的不利影响. 研究表明, 重链的分泌低下是导致FVⅢ分泌低效性的主要原因. 我们最近的研究表明, 应用蛋白质剪接技术的双载体转B区缺失型FVⅢ(BDD-FVⅢ)基因, 通过表达后重链和轻链的共价连接, 轻链可顺式促进剪接BDD-FVⅢ的分泌, 但重链分泌的低下影响分泌的水平. 本文将具有促进FVⅢ分泌作用的L303E/F309S点突变引入FVⅢ的重链, 通过蛋白质剪接的双载体共转断裂全长FVⅢ基因, 观察了重链和剪接全长FVⅢ的分泌和生物活性的变化. 构建了一对融合Ssp DnaB蛋白内含子(intein)的突变重链和轻链真核表达载体, 瞬时共转染培养的COS-7细胞, Western blotting结果表明转基因细胞有明显的剪接FVⅢ蛋白表达; 突变重链单独转基因后的分泌量为(39±11) ng/mL, 明显高于野生型重链的分泌量; 与轻链共转基因的重链分泌量增加到(123±13) ng/mL, 培养上清中分泌的剪接FVⅢ量和活性分别为(86±14) ng/mL和(0.61±0.08) IU/mL, 明显高于断裂的野生型FVⅢ共转基因. 另外, 转突变重链和轻链基因细胞的合并培养上清中亦检测到剪接的FVⅢ蛋白和生物活性, 且高于转野生型重链和轻链基因细胞的合并培养上清. 结果表明, 重链分泌性的改善可提高运用蛋白质剪接技术的双载体转断裂的全长FVⅢ基因的功效, 为动物体内进一步运用双AAV载体转全长FVⅢ基因提供了实验依据.     

番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的分离及其内含子功能

应用PCR技术,从番茄中分离了具有一个内含子的蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的核基因。该内含子序列（TPI）的长度为109bp,两端存在着典型的GT／AG双核苷酸结构,其AT碱基对的含量非常高,约占核苷酸对总数的80．7％。DNA重组实验表明,TPI序列能够有效地促进报告基因gusA的表达水平,而且这种促进作用与该序列的插入位置及方向均无关系,呈现出明显的增强子特性。另外,GUS酶组织化学染色、荧光检测以及凝胶阻滞等实验等均证明TPI序列可能还具有启动子的活性,番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的核基因序列在GenBank中的登记号为AY007240.     

利用ubi1内含子增强Bt cry1Ah基因在转基因玉米中的表达

Bt cry1Ah基因是从国内苏云金芽胞杆菌分离株BT8中鉴定克隆的新型杀虫蛋白基因. 本研究构建了两个含有Bt cry1Ah基因的植物表达载体, 在其中一个植物表达载体(pUUOAH)的玉米Ubiquitin启动子与cry1Ah基因之间插入了玉米泛素蛋白基因ubiqutin1的第一个内含子(ubi1). 利用基因枪法将其导入玉米(Zea mays L.)胚性愈伤组织中, 得到了可育的再生植株. PCR及Southern blot检测结果表明, cry1Ah基因已整合入玉米基因组中, 并稳定遗传至下一代. 对T₁及T₂代转基因植株进行ELISA检测, 发现pUUOAH载体转基因植株Cry1Ah蛋白的平均表达量提高了20%. 对T₂代转基因植株进行了田间抗虫性鉴定, 发现转cry1Ah基因玉米对玉米螟有很高的抗性, 并且pUUOAH载体转基因植株的抗虫性好于pUOAH(无内含子)载体的转基因植株. 以上结果表明, 玉米ubi1内含子可以有效增强cry1Ah在转基因玉米中的表达.     

大鼠与小鼠内含子中插入、缺失与替换的速度与模式

研究了啮齿类动物大鼠与小鼠内含子中插入(insertion)、缺失(deletion)和替换(substitution)发生的速度与模式. 结果表明, 缺失比插入发生的频率高, 在大鼠和小鼠中单个碱基的插入与缺失发生频率最高. 插入与缺失发生次数随长度的增加而迅速减少, 二者的理论分布都符合幂次法则(power-law). 在大鼠内含子中, AT→GC的替换频率高于GC→AT, 但在小鼠内含子中GC→AT的替换频率高于AT→GC. 大鼠与小鼠内含子中存在的缺失偏好表明, 由于可能降低转录与剪切的效率, 内含子中的插入比缺失更容易受到自然选择的制约. 此外, 大鼠与小鼠内含子中的替换模式表明, 其内含子的组成及GC含量都处于非平衡状态.     

水稻OsEBP-89基因部分转录本中第1内含子的滞留

OsEBP-89基因是水稻中一个转录因子编码基因。该基因含有两个内含子,采用RT－PCR和Southern杂交等方法的检测结果表明,在OsEBP-89基因的部分转录本中,115bp长的第1内含子未被剪接。从水稻cDNA文库也筛选到了仍然保护有第1内含子的OsEBP-89基因的cDNA克隆。OsEBP-89基因第1内含子不完全剪接的转录本与正常成熟转录本的比例在水稻不同组织中是不同的。这是真核基因中内含子滞留的一个新的例子。     

蛋白质剪接在蛋白质研究和蛋白质工程中的应用

蛋白质剪接(protein splicing)是由蛋白质内含子介导的在蛋白质水平上翻译后的加工过程。蛋白质内含子(intein)是指前体蛋白中的一段插入序列,它在蛋白质翻译后的成熟过程中能自我催化,使自身从前体蛋白中切除,并将其两侧的多肽片段以肽键连接,形成成熟的蛋白质。蛋白质内含子的发现丰富了基因表达和蛋白质翻译成熟过程的理论,而且在蛋白质研究和蛋白质工程中有广泛的应用。本文试图综述蛋白质剪接在蛋白质特异位点标记、蛋白质片段化标记同位素、蛋白质环化、蛋白质芯片、基因治疗等研究中的应用。      

粉尘螨过敏原在转基因植物中的致敏活性分析

在转基因食品潜在致敏性的研究中, 将粉尘螨过敏原基因(Derf₂)引入植物中表达. 经PCR, Southern和Northern杂交以及ELISA检测证明, 外源基因已发生整合并正常表达, 表明转基因烟草作为一个实验系统来研究基因产物的致敏性是可行的. 同时, 采用RT-PCR从转基因烟草中扩增出经植物加工后的致敏原基因Derf₂片段, 序列比对证明植物(烟草)能对动物(粉尘螨)的内含子进行正确识别和有效剪切.     

蛋白质内含子的特征序列分析及模体修正

自从1990年在Saccharomydes cervisiae腺苷三磷酸核酸酶中发现第1个蛋白质内含子（Sce VMA)后,蛋白质内含子的数量在不断增多,分析这些新的蛋白质内含子序列,对正确认识它们的序列特征是非常必要的,通过系统搜索核酸以及蛋白质序列数据库,收集到蛋白质内含子101个,其中含LAGLI－DADG自导引核酸内切酶模体的蛋白质内含子序列69个,由于典型蛋白质内含子是包含自导引核酸内酶模体的,而且占蛋白质内含子的绝大多数,所以只分析这69个典型蛋白质的含子,发现这些蛋白质内含了的分布在物种以及蛋白质种类之间都有其特殊性,通过多序列联配还发现了蛋白质内含子在序列上的一些新特征,并对已有的蛋白质内含子的模体进行修正。