耐辐射奇球菌RadA蛋白参与DNA损伤修复过程

RadA是一个高度保守的蛋白. 在古细菌中, RadA蛋白具有RecA类似的功能并在同源重组过程中起关键作用. 在大肠杆菌中, RadA蛋白也参与了同源重组和DNA损伤修复过程, 但远没有在古细菌中的功能那么重要. PSI-BLAST结果表明, 与古细菌以及真核细胞中RadA蛋白相比, 耐辐射奇球菌RadA蛋白和细菌中的RadA的相似性更高. 研究发现, 耐辐射奇球菌radA基因的突变增加了耐辐射奇球菌对γ射线和紫外线照射的敏感性, 但对过氧化氢氧化胁迫的抗性没有影响. 耐辐射奇球菌和大肠杆菌radA基因均能完全补偿突变体对γ射线和紫外线辐照的抗性. 进一步的结构域功能分析表明, 与radA突变体的抗性相比, 锌指结构域的缺失导致耐辐射奇球菌对γ射线和紫外线辐照更加敏感; 仅仅缺失Lon蛋白酶结构域的耐辐射奇球菌表现为比radA突变体略微更抗γ射线和紫外线辐照处理. 这些实验结果表明, 耐辐射奇球菌RadA蛋白的确参与了DNA损伤修复过程, 而且不同的结构域具有不同的功能.     

细胞色素c氧化酶可溶性CuA结构域的表达、分离纯化和初步表征

细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ含有可溶性双核铜中心CuA结构域蛋白。报道了Paracoccus versutus菌CuA结构域的基因克隆、表达和分离纯化及其初步表征。编码CuA结构域的基因插入pET11d质粒载体中,于E.coli BL21(DE3)中进行表达。结果表明,CuA结构域蛋白在这个表达体系中主要以包涵体的形式存在,表达量占菌体总蛋白的10％左右。经尿素溶解,Cu^ /Cu^2 重组复性,Q－Sepharose快速阴离子交换柱和Sephadex-G75凝胶过滤柱纯化,得到了电泳纯的紫红色可溶性蛋白。紫外－可见吸收光谱在478nm有较强吸收峰,530nm处有一肩峰,在360和806nm处有弱吸收峰,它们可归属为混价双金属核中心（Cu2S2R2)中Cu-S和Cu-Cu间的电荷转移与轨道相互作用。圆二色谱表明其二级结构主要为β－折叠形式。荧光激发谱最大波长为280nm,发射谱最大波长为345nm。     

PAS结构域介导Org35蛋白与NifA之间相互作用

在巴西固氮螺菌中, 氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子, 即高浓度的氧和铵抑制固氮作用. NifA蛋白(nifA基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白. 目前, 在该菌中, 氧和铵对NifA蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚. 本研究从巴西固氮螺菌中克隆到编码含有PAS结构域蛋白的org35全基因, 将根据org35的核苷酸序列推测的Org35蛋白氨基酸序列在NCBI网上进行同源性比较, 结果表明, Org35蛋白属于杂合双组分调节系统, 包括3个结构域, 即N-端PAS结构、中间组氨酸激酶结构域(HPK)和C-端响应调节蛋白结构域(RR). 并通过酵母双杂交系统证明了Org35蛋白与NifA蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的.     

GS3 蛋白不同结构域的功能与水稻谷粒大小的关系

许多禾谷类作物的产量在很大程度上由谷粒的大小所决定. 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室张启发研究组, 研究了GS3 的遗传和分子特征, 这是一个主要的决定谷粒大小的数量性状位点. 研究显示, GS3 是一个谷粒大小和器官大小的负调节因子. 其野生型形式推测由4 个结构域构成: 位于N 端的植物特异性器官尺寸调节(OSR)结构域和跨膜结构域以及位于C 端的肿瘤坏死因子/神经生长因子受体(TNFR/NGFR)家族富胱氨酸结构域和C 型血管性血友病因子(VWFC). 这些结构域具有不同的调节谷粒大小的功能. OSR 结构域作为一个负调节因子的功能是充分必要的. 野生型等位基因对应于中等谷粒. OSR 功能缺失结果可导致长的谷粒.位于C 端的TNFR/NGFR 和VWFC 结构域表现出对OSR 功能的抑制性效应, 它们的功能缺失突变可产生非常短的谷粒.该研究将GS3 蛋白的功能结构域与水稻谷粒大小的自然变异联系起来. 相关研究发表在2010 年11 月9 日Proc Natl Acad Sci USA, 107(45): 19579—19584 上.     

巴西固氮螺菌NifA与PⅡ蛋白之间的相互作用

利用酵母双杂合系统研究了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasielense)NifA与P_Ⅱ蛋白之间的相互作用. 结果表明: P_Ⅱ蛋白能和完整NifA蛋白自身或其N-端结构域特异结合, 不能与NifA的中间或C-端结构域相互作用; 与P_Ⅱ 蛋白高度同源的Pz蛋白(即GlnK)也不能与NifA结合. 将编码P_Ⅱ蛋白的glnB基因进行移码突变后, 突变的P_Ⅱ蛋白失去了与NifA蛋白结合的功能. 这说明NifA确实可与P_Ⅱ蛋白特异地结合, 但它们之间相互作用的机制尚待进一步研究分析.     

分选链接蛋白家族研究进展

分选链接蛋白(sorting nexins,SNXs)是一类含有吞噬细胞氧化酶同源性结构域(Phoxhomology domain,PX domain)蛋白的统称,在哺乳动物中有33个成员,其PX结构域易与定位于早期内涵体的磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol-3-phosphate Ptd Ins(3)P)结合,参与蛋白跨膜过程中货物分子接头蛋白与膜锚定蛋白的结合等蛋白间的相互作用,故SNXs在细胞内吞、蛋白分选、细胞信号转导、膜运输、膜重塑和细胞器运动等方面均起重要作用.不同SNXs尚含差别较大的其他结构域,据差异结构域的不同,可进一步分为3大类.其中某些成员参与肿瘤、阿尔茨海默症、神经疾病和心脏病等人类重大疾病的发生.本文概述其发现、基因定位、结构、分类、功能及相关疾病等的研究现状,并展望其相关动向.     

BICP0和其环指结构域具有E3泛素连接酶活性

1型牛疱疹病毒(BHV-1)早早期(immediate early, IE)基因所编码的调控蛋白BICP0可决定病毒的感染方式, 具有多种转录调控功能. 它能促进病毒自身IE基因、早期(early, E)基因和晚期(later, L)基因以及其他一系列细胞基因的表达. 为研究其作用机理, 在E. coli中表达纯化了BICP0及其各种缺失突变蛋白. 体外活性实验表明, BICP0全长蛋白和其具有环指(ring finger)结构域的N端蛋白可以催化多聚泛肽链的形成, 具有E3泛素连接酶的功能, 暗示BICP0的转录激活功能可能通过其泛素连接酶功能实现, 为阐明BICP0在病毒感染中的作用机理提供了新视角.     

磁螺菌MSR-1磁小体缺失突变株NM21 Tn5侧翼序列的克隆及功能分析

利用mini-Tn5 lacZ2对磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense) MSR-1进行转座插入突变, 获得磁小体缺失突变株NM21. 通过锚定PCR从NM21中克隆出Tn5插入位点的侧翼序列, 获得长3073 bp的DNA片段, 其中含有3个ORF, Tn5插入在ORF1中, 互补实验证明该片段与磁小体合成相关. 对ORF1编码的蛋白进行同源比较和功能分析, 发现ORF1编码的蛋白中部有4个跨膜螺旋, 与其同源性较高的序列全部为二价阳离子转运蛋白. BLAST软件分析表明, ORF1编码的蛋白具有COG0053和PRK09509结构域, 与FieF和MMT1等二价阳离子转运蛋白家族CDF (cation diffusion facilitator)有相同的结构域, 推测其为磁小体膜上Fe2+的转运蛋白, 且可能在去除Fe2+对细胞毒害的过程中起着重要作用.     

人神经生长因子β亚基的基因在P.pastoris和E.coli中的表达

将hNGFB基因插入甲醇营养性酵母P .pastoris分泌表达载体pHIL S1和E .coli表达载体pET 15b中 ,相应转化P .pastorisGS115 (Mut+,His- )和E .coliBL2 1(DE3 ) .在不含组氨酸平板上生长的酵母转化子通过PCR进一步筛选阳性克隆 ,P .pastoris重组菌株的蛋白电泳表明发酵液中有特异表达带 ,扫描分析占细胞外泌总蛋白的 14 .4% ,Westernblotting证实该分泌蛋白具有hNGF的免疫活性 .E .coli重组菌株在IPTG的诱导下表达融合蛋白 .电泳扫描分析表达的融合蛋白占细胞总蛋白量的 10 .3 % ,Westernblotting检测表明具有免疫活性 .     

用酵母双杂交系统筛选与NifA相互作用的蛋白质

利用酵母双杂合系统从巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Sp中筛选与NifA有直接相互作用的蛋白质因子. 首先将nifA基因克隆到pGBD-C2载体上, 构建成诱饵质粒pGBD-nifA, 接着将巴西固氮螺菌的染色体DNA构建在pGAD-C1, pGAD-C2和pGAD-C3质粒载体上, 形成3个质粒文库YSPC1, YSPC2和YSPC3. 然后以pGBD-nifA为诱饵, 对YSPC1, YSPC2和YSPC3这3个文库进行了筛选, 得到11个阳性克隆. DNA序列分析表明, 这11个阳性克隆分为4类, 包含4个1~1.3 kb不同的基因片段. 对这4个基因片段进行同源性比较发现, 其中2个编码的蛋白质含有与信号传递有关的PAS结构域, 另外1个基因片段含有与吸收铁有关的fhuE基因, 另一个是未知蛋白. 将这4个基因片段从原来的pGAD载体转移到pGBD载体, 即互换换载体后, 它们仍然与NifA有相互作用; 对这4个基因片段进行移码突变则不再与NifA有相互作用, 说明了它们与NifA相互作用的特异性.     

水稻WRKY89中的亮氨酸拉链结构增强蛋白与W盒元件的相互作用

WRKY蛋白是一类参与植物生物和非生物胁迫反应、代谢、发育等过程的转录调节因子. 水稻WRKY89与其他的WRKY成员同源性较低, 推测由263个氨基酸组成, 其N端带1个可能的亮氨酸拉链结构. 采用pET-29b载体原核表达了OsWRKY89和其3个N端缺失的衍生物, 并采用Ni柱的方法对表达的蛋白进行了纯化. 凝胶阻滞结果表明, OsWRKY89能与含顺式元件W盒的DNA序列特异结 合, 而缺失N端亮氨酸拉链的OsWRKY89与该元件的结合能力显著下降. 酵母双杂交结果表明, 亮氨酸拉链样结构参与OsWRKY89蛋白的同源相互作用. 进一步缺失OsWRKY89至部分WRKY结构域导致表达的蛋白完全丧失与上述元件的结合活性, 表明WRKY结构域是DNA结合中不可缺少的. 这些结果说明亮氨酸拉链结构在蛋白质与蛋白质互作和DNA与蛋白质中起重要作用.     

不同构象状态HIV-1 gp120分子运动特征及构象转换能力研究

人类免疫缺陷病毒HIV-1包被蛋白gp120通过与宿主细胞表面受体CD4和辅助受体CCR5/CXCR4发生相互作用而侵染细胞. CD4结合状态的HIV-1 gp120核心与CD4结合前状态的SIV gp120核心结构已经被X射线晶体衍射技术所测定. 但是, 静态的晶体结构不足以阐明gp120动态结构特征及其构象转化能力. 用同源模建技术构建不同功能状态的gp120结构模型并用CONCOORD模拟方法生成它们的结构装配体, 最后利用本质动力学算法提取、分析前4个本征向量所描述的分子运动特征. 结果表明, gp120的主要运动模式表现为内部结构域、外部结构域、桥片层以及V3环之间的旋转/扭曲、绕曲/关闭、延长/压缩运动或这些运动方式的组合, 这些运动模式与受体结合以及HIV-1病毒免疫耐受性有关. 进一步利用本质亚空间重叠算法评估gp120不同构象间的相互转换能力, 结果表明, CD4结合前状态(unliganded) gp120向复合物状态(CD4-complexed)转化的能力强于向移除CD4复合物状态(CD4-free)转化的能力, 而CD4-free gp120比CD4-complexed gp120具有更强的向结合前状态转化的能力. 本研究揭示了gp120动态结构与功能的关系, 并为抗HIV药物设计提供了参考和帮助.     

预测和分析血吸虫含有EF-hand结构域的表膜蛋白的功能

血吸虫病仍然是严重危害人类健康的重要寄生虫疾病之一. 在血吸虫中发现一类特殊的表膜蛋白, 它们含有EF-hand结构域, 但是对它们功能的了解除了可以作为抗原之外几乎一无所知. 蛋白-蛋白相互作用、位点特异性变异和糖基化位点修饰等in silico分析的结果表明, 这类表膜蛋白不仅可以与具有免疫调节功能的宿主蛋白进行相互作用来帮助血吸虫主动调节宿主的免疫反应, 还可以通过位点特异性变异、糖基化修饰自身那些可以被宿主免疫攻击所识别的位点, 以帮助血吸虫被动调节宿主免疫攻击. 此外, 对表膜蛋白C端区域的分析表明, 这些蛋白还可以协助血吸虫抑制宿主多核细胞的细胞趋化和宿主的IgG4免疫反应来调节和逃避宿主的免疫攻击. 总之, 分析结果暗示, 这些表膜蛋白可以协助血吸虫在宿主-寄生虫相互作用过程中调节和逃避宿主的免疫攻击, 起到自我保护的作用.     

埃博拉病毒入侵:人TIM分子的结构与结合PS的分子基础

研究表明,人T细胞免疫球蛋白黏蛋白(human T-cell immunoglobulin and mucin domain,h TIM)受体分子能够促进包括埃博拉病毒在内的很多囊膜病毒的入侵.h TIM介导的病毒入侵过程高度依赖于位于受体分子胞外区远膜端的免疫球蛋白V区(immunoglobulin variable(Ig V)-like)结构域与病毒囊膜中磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)的特异性相互作用.人类TIM家族共有3个成员:h TIM-1,h TIM-3和h TIM-4.虽然相应的小鼠TIM分子的结构已经解析,但h TIM分子的Ig V结构特征及其识别PS的分子基础仍然未知.同时,有研究表明,引起西非大规模埃博拉疫情爆发的2014-扎依尔-埃博拉病毒可能较其先前流行株具有更强的致病能力.但目前尚未有2014-扎依尔-埃博拉病毒利用h TIM分子入侵细胞及其与1976-扎依尔-埃博拉病毒的入侵能力比较的研究报道.本研究证明了整合有1976-和2014-扎依尔-埃博拉病毒囊膜糖蛋白(glycoprotein,GP)的假病毒均可以利用h TIM-1和h TIM-4入侵细胞,并且表现出相近的入侵效率.进一步证明了h TIM分子不与埃博拉病毒GP蛋白直接相互作用,而是通过结合病毒囊膜中的PS分子而促进病毒感染.随后解析了3种h TIM分子Ig V结构域的高分辨率晶体结构以及h TIM-4与磷酸丝氨酸的复合物晶体结构.令人意外的是,3种h TIM分子的PS结合槽呈现出各自不同的局部结构特征且在目前已解析结构的小鼠同源分子中均未被观察到.这些结构特征很可能提示h TIM分子具有不同于小鼠同源分子、且彼此间亦各不相同的PS识别模式.上述结构和功能数据丰富了我们对h TIM结合PS的分子基础的认识,从而将帮助我们更深入地了解埃博拉和相关囊膜病毒利用h TIM受体入侵细胞的分子机制.     

同源于hMIP-1a 的vMIPa 对人趋化因子受体的作用

HIV感染靶细胞须以人CD4+白细胞膜上的趋化因子受体为共受体, 与此共受体结合的趋化因子类似物可阻止HIV进入靶细胞. 实验目的是了解与人趋化因子单核细胞炎性蛋白-1a (MIP-1a)同源的人疱疹病毒8 K6基因编码产物vMIPa 是否具有结合人趋化因子受体的功能. 首先用蛋白质同源分析及蛋白空间结构模拟等对比vMIPa与人趋化因子的结构异同, 用PCR扩增出K6片段, 克隆于哺乳类细胞表达载体, 转染于NIH3T3细胞, 得到条件培养液. 然后将K6基因在大肠杆菌中表达, 得表达产物vMIPa. 结果显示转染K6的NIH3T3细胞含有vMIPa单一分子量的mRNA, 此转染细胞的条件培养液及大肠杆菌表达纯化的vMIPa可与人趋化因子125I-hMIP-1a竞争结合外周血单核细胞的CCR5受体, 而且此条件培养液及vMIPa不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应. 研究证实K6编码产物vMIPa与CCR5结合但不引起细胞黏附反应, 即封闭HIV的CCR5共受体, 提示有用于防治HIV/艾滋病的可能性.     

同源于hMIP-1α的vMIPα对人趋化因子受体的作用

HIV感染靶细胞须以人CD4+白细胞膜上的趋化因子受体为共受体, 与此共受体结合的趋化因子类似物可阻止HIV进入靶细胞. 实验目的是了解与人趋化因子单核细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)同源的人疱疹病毒8 K6基因编码产物vMIPα是否具有结合人趋化因子受体的功能. 首先用蛋白质同源分析及蛋白空间结构模拟等对比vMIPα与人趋化因子的结构异同, 用PCR扩增出K6片段, 克隆于哺乳类细胞表达载体, 转染于NIH3T3细胞, 得到条件培养液. 然后将K6基因在大肠杆菌中表达, 得表达产物vMIPα. 结果显示转染K6的NIH3T3细胞含有vMIPα单一分子量的mRNA, 此转染细胞的条件培养液及大肠杆菌表达纯化的vMIPα可与人趋化因子125I-hMIP-1α竞争结合外周血单核细胞的CCR5受体, 而且此条件培养液及vMIPα不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应. 研究证实K6编码产物vMIPα与CCR5结合但不引起细胞黏附反应, 即封闭HIV的CCR5共受体, 提示有用于防治HIV/艾滋病的可能性.     

神经红蛋白的表达、分离纯化和谱学表征

报道了神经红蛋白(NGB)的基因表达、分离纯化和谱学表征. 将载有NGB基因的pET3a质粒转入E.Coli BL21(DE3)plys细菌, 于TB培养基中进行表达, 其表达量占菌体总蛋白的10%左右. 依次经硫酸铵分级沉淀, DEAE-Sepharose阴离子交换柱, Hiload16/60 Superdex 75凝胶过滤柱和Hiprep 16/10 Q FF 阴离子交换柱纯化, 得到了电泳纯的血红色可溶性蛋白. 电喷雾质谱测得其分子量为16930.0 Da. 紫外-可见吸收光谱表明, 还原态的NGB在425 nm有一强吸收峰, 在531和559 nm处有弱吸收峰, 它们可分别归属为金属卟啉的γ,β和α吸收带, 氧化态的NGB在413 nm处有强吸收, 则对应于金属卟啉的γ吸收带, 是电子在卟啉环中非定域化π电子的轨道跃迁(π→π*)的结果. 荧光激发谱最大波长为281 nm, 发射谱最大波长为338 nm. 圆二色谱表明其二级结构为典型的a螺旋结构, 在410 nm处有一血红素正峰. 酸稳定性研究表明, pH>4时蛋白稳定.     

家蚕硒蛋白组的计算机识别

硒是一种生物必需微量元素, 主要以硒蛋白形式发挥生物学功能. 硒蛋白的生物合成取决于硒代半胱氨酸插入蛋白质的合成过程. TGA码既是终止码, 又可翻译成硒代半胱氨酸, 这使普通基因注释软件无法正确预测硒蛋白, 导致现有数据库中许多物种的硒蛋白被错误注释或丢失. 本研究基于已公布的家蚕基因组预测信息、采用PERL语言编程, 对家蚕基因组中硒蛋白进行了计算机检索与分析. 结果表明, 在家蚕数据库18510个已注释基因中, 以TGA码终止的基因有6348条, 其中含有SECIS结构的基因249条, 兼含半胱氨酸同源类似物的基因52条. 再经硒代半胱氨酸(Sec)侧翼序列比对, 最终检索到完全具备硒蛋白特点的基因5条, 其中谷胱甘肽硫转移酶(GST)是一种已知微生物硒蛋白, 而其他4种则是新硒蛋白, 分别在已有基因表中被注释为CG6024蛋白, CG5195蛋白, ATP-结合盒转运蛋白A型(ABCA)和核VCP相似蛋白. 通过对GST, ABCA和VCP主要性质的分析, 推测家蚕硒蛋白在氧化调节、硒储存运输和细胞凋亡等过程中起重要作用.     

拟南芥QRAP2基因的克隆、表达、DNA结合能力及体外转录活性分析

通过对拟南芥ATH1基因芯片数据的分析, 从拟南芥中鉴定到一个受干旱胁迫高水平诱导的cDNA片段, 并用RACE方法获得了其全长cDNA. PCR及定量实时PCR分析表明, 该基因在经干旱、紫外线照射、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高, 特别是干旱处理后短时间内表达量迅速提高, 3 h后即提高到对照样品的430多倍. 通过多序列比对和系统进化分析, 我们将该基因归于DREB亚家族. 由于该基因编码蛋白含有典型的AP2/EREBP DNA结合结构域, 并在N端有一段富含谷氨酰氨残基的区域, 所以将它命名为QRAP2 (Glutamine-rich AP2). 凝胶阻滞实验结果显示, QRAP2蛋白能够特异结合DRE顺式元件序列但不能与mDRE和GCC等非相关元件结合. 酵母单杂交实验表明, QRAP2蛋白全长序列或其N端112个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域形成的融合蛋白表现出转录激活功能, 而其C端135个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域的融合蛋白则没有表现出转录激活活性. 现有资料的分析表明, QRAP2是AP2/EREBP转录因子家族的新成员, 可能在干旱胁迫条件下参与激活相关下游基因的表达.     

突触结合蛋白Ⅰ的C2A结构域的两种膜结合状态及Ca2+引发的插膜

突触结合蛋白(synaptotagmin)Ⅰ是神经细胞突触囊泡上的一个膜整合蛋白, C2A是它的具有重要功能的近膜胞质片段. 近年来的研究表明, 突触结合蛋白Ⅰ在Ca²⁺引发的神经递质快速释放过程中起到Ca²⁺感受器的作用, 而C2A结构域与神经细胞的突触前膜的相互作用与其 Ca²⁺感受器的功能密切相关, 但是其作用机制还不清楚. 利用气/液单层膜技术结合表面密度的测量, 发现C2A存在两种膜结合状态: 无 Ca²⁺时, 以静电作用力为主的表面吸附状态; 有 Ca²⁺时, 静电力起部分作用的插膜状态. 两种状态时C2A都倾向于与带负电荷, 如磷脂酰丝氨酸的磷脂膜结合. 将C2A转染表达在PC12和HEK-293细胞中, 利用免疫染色和Western blot检测也表明, C2A在有无Ca²⁺存在的情况下都主要存在于膜附近. 实验结果提示, 突触结合蛋白Ⅰ作为Ca²⁺感受器的可能分子机制: 突触结合蛋白Ⅰ的C2A的表面吸附功能在囊泡锚定或活化时协助囊泡附着在活化区, 当细胞内Ca²⁺浓度迅速增加, C2A Ca²⁺依赖的插入负电荷膜的特点可以将囊泡拉近突触前膜, 加之同时和其他蛋白, 如SNARE复合物的作用引发膜的融合.