水稻黑条矮缩病毒基因组组合10编码的外壳蛋白基因的克隆及表达

从我国山东发病的玉米材料中提取水稻黑条矮缩病毒，抽提病毒RNA，经RT－PCR，克隆了编码外层外壳蛋白的基因组组分10（S10）的cDNA，并进行了序列测定。与已报道的日本株和湖北等地的S10进行了序列同源性比较。结果表明，与日本株的同源性为92％，与湖北等地的同源性在97％－98％之间。将该序列构建到pGEX-3X表达载体中，经IPTG诱导，表达了分子质量约为76ku的GST融合蛋白。经亲和层析纯化和Western印迹分析，证实了该基因以可溶性的GST融合蛋白形式在原核中表达。     

水稻黑条矮缩病毒基因组组分10编码的外壳蛋白基因的克隆及表达

从我国山东发病的玉米材料中提取水稻黑条矮缩病毒 ,抽提病毒RNA ,经RT PCR ,克隆了编码外层外壳蛋白的基因组组分 10 (S10 )的cDNA ,并进行了序列测定 .与已报道的日本株和湖北等地的S10进行了序列同源性比较 .结果表明 ,与日本株的同源性为 92 % ,与湖北等地的同源性在 97%～ 98%之间 .将该序列构建到pGEX 3X表达载体中 ,经IPTG诱导 ,表达了分子质量约为 76ku的GST融合蛋白 .经亲和层析纯化和Western印迹分析 ,证实了该基因以可溶性的GST融合蛋白形式在原核中表达 .     

云南3个不同地区水稻矮缩病毒S8片段的序列分析

用RT-PCR方法从云南昆明、玉溪和陆良3个地区的水稻样品中扩增到水稻矮缩病毒S8全长片段,核苷酸测定及序列分析表明,水稻矮缩病毒云南昆明、玉溪及陆良分离物S8片段全长均为1356 bp,含一个1266 bp的ORF,编码421个氨基酸.核苷酸和氨基酸同源性分析表明,4个中国分离物S8片段之间的核苷酸同源性为97.9%,其编码的氨基酸同源性为98.6%;4个中国分离物与日本分离物的S8片段核苷酸同源性和氨基酸相似性分别为94.7%和98.1%.昆明、陆良、玉溪和福建分离物应属同一株系,而日本分离物应属另一株系.     

探讨不同因素对白背飞虱在稻苗间传播南方水稻黑条矮缩病毒效率的影响

结果表明,白背飞虱(5龄若虫、长翅型和短翅型成虫)在18~34℃的温度区间内均能在不同生育期的水稻上传毒,传毒率在3.3%~41.2%间.介体发育阶段、环境温度和水稻生育期均能显著影响该虫的传毒能力(P0.01),不同发育阶段白背飞虱的传毒能力依次是5龄若虫短翅型成虫长翅型成虫;26℃时该虫传毒率最高,其次是22℃,最后依次是28℃、18℃和34℃;苗龄越低传毒率越高.这三者中任意2因素间都有极显著的互作效应(P0.01),它们对该虫传毒的影响顺序依次是温度水稻生育期介体发育阶段环境温度×介体发育阶段环境温度×水稻生育期介体发育阶段×水稻生育期.不同品种的感染率不同,5个品种感染率从高到低的顺序分别是陵两优268(41.7%)、金优899(37.6%)、金优284(36.2%)、培两优981(32.1%)和威优644(29.3%).其中,陵两优268的感染率显著高于其它品种(P0.05),金优898和金优284之间感染率差异不显著(P0.05),威优644的感染率显著低于其它品种(P0.05).禁食时间在12 h以上时,该虫传毒能力显著降低(P0.05).白背飞虱在稻苗间的传毒效率与水稻品种、环境温度、该虫发育阶段、水稻品种及生育期、该虫禁食时间长短密切相关,其中水稻生育期、温度和白背飞虱的发育阶段间还存在极显著的互作效应.     

南方水稻黑条矮缩病的诊断与防控

南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)来势凶猛,危害水稻损失极大,为指导好农业科技人员组织各方面人力、物力开展有效防治,有必要掌握相关的诊断方法和防控技术,现做一个简介和探讨。     

水稻矮缩病毒基因组分析与部分基因片段的表达及功能研究

根据本实验室对水稻矮缩病毒中国福建分离株基因组全序列的测定。分析了其编码蛋白的功能,并将ＲＤＶＳ６,Ｓ９,Ｓ１０,Ｓ１１编码区ｃＤＮＡ分别克隆到表达载体ｐＴｒｃＨｉｓＡ,ｐＢＶ２２１,ｐＴｒｃＨｉｓＢ和ｐＢＶ２２１中,构建成表在挝 ｐＴＨ－Ｓ６,ｐＢＶＰ９,ｐＴＨ－２１０,ｐＢ－ＶＰ１１。     

蜂毒肽前体蛋白cDNA的克隆及序列分析

从蜜蜂（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）毒腺中提取总ＲＮＡ,通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到了蜂毒肽前体蛋白的ｃＤＮＡ。扩增产物克隆到ｐＴ７Ｂｌｕ－Ｔ载体,再进一步将插入片段酶切连接到ＰＵＣ１１８载体上,构建了与β－半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒肽前体蛋白表达体并转化大肠杆菌ＪＭ１０９。     

2010年南方水稻黑条矮缩病应急防控试验探究

南方水稻黑条矮缩病是一种严重为害水稻生产的病毒病,目前没有十分有效的防控措施,特别是对已经大面积暴发成灾的本田期水稻。本研究在江西省萍乡市芦溪县麻田乡,针对整个田块已经发生病毒病的二晚移栽稻田,进行应急防控实验,探究不同药剂组合对南方水稻黑条矮缩病的防治效果。试验以杀虫剂、抗病毒剂、生长调节剂、免疫激活剂和生物肥料为材料,通过不同的组合和不同的施药次数,探讨不同处理的防治效果,试验发现不同的药剂组合对防治南方水稻黑条矮缩病的确存在不同的防治效果,最高防治效果可达46.75%。这些研究为下一步研究防治水稻病毒病应急防控措施奠定基础。     

豇豆钙调蛋白cDNA的克隆及序列分析

从豇豆成熟叶片中提取总RNA,反转录合成cDNA第一链,根据钙调蛋白结构基因两端保守序列设计引物,PCR扩增豇豆钙调蛋白基因,克隆到T-easy载体上并测定了其全序列.序列分析结果表明,豇豆钙调蛋白基因由450个核苷酸组成,编码150个氨基酸.与已知的多种植物钙调蛋白基因相比有很高的相似性,核苷酸序列相似性在80%以上,编码的氨基酸序列相似性在90%以上.     

利用噬菌体展示筛选结合水稻条叶枯病毒S蛋白的短肽

利用噬菌体展示技术在随机7肽库中筛选到结合水稻条叶枯病毒（rice stripe virus ,RSV）病害特异蛋白（stripe disease-specific protein,S蛋白）的6个短肽,并进行了序列测定,ELISA结果表明,6个短肽和S蛋白具有一定的亲和能力,筛选到的短肽对今后S蛋白功能分析、转基因抗RSV和水稻条叶枯病的诊断提供了条件。     

ICAM-1特异结合肽的淘选与性质研究

利用噬菌体展示载体pCANTAB5G8构建了随机十五肽库,根据转化率计算库容量为1.36×108.用PCR-SSCP检验了库的异质性.以固相包被亲和淘选的方法,经过4轮淘选和ELISA分析,得到了5个可与重组人细胞间粘附分子1(ICAM-1)特异结合的噬菌体克隆,对所展示的十五肽进行了序列分析.其中活性较高的噬菌体展示十五肽与ICAM-1的亲和常数约为7.87 ×107.     

水稻全长均一化cDNA文库构建及SDG725结合蛋白筛选

为了筛选水稻组蛋白甲基转移酶SDG725的结合蛋白,构建了水稻全长均一化cDNA文库,以SDG725C末端为诱饵蛋白对cDNA文库进行筛选.最后筛选到70个可能与SDG725相互作用的蛋白,同时对筛选出的候选蛋白进行GO功能分析和亚细胞定位预测,并对部分蛋白与蛋白相互作用进行了验证.研究结果发现筛选到的结合蛋白有17%位于细胞核中,更多位于核外,为进一步研究SDG725的生物学功能提供理论基础.     

胰岛素受体短肽配体的亲和筛选

以高效表达胰岛素受体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-IR)为筛选靶标, 经过一轮酸洗脱和三轮特异性竞争洗脱筛选, 成功地富集了与胰岛素受体结合的重组噬菌体克隆. 随机挑 取噬菌体克隆检测其与胰岛素受体的结合活性, 选取结合力最强的6个单克隆, 测得其与 CHO-IR之间的Ｋ_d值为纳摩级, 表明为特异性结合; 经序列分析表明短肽之 间有明显的基序存在.     

人乳铁蛋白(hLF)cDNA的克隆及序列分析

从正常人外周血中分离中性粒白细胞（WBC）,提取总RNA,用RT—PCR的方法扩增人乳铁蛋白（hLF）cDNA．cDNA分hLF1．5、hLF0．8两段扩增并连入pMD18-T载体上,再利用限制酶连入巴氏毕赤酵母表达载体pPICZα—A中,构成完整的hLF基因．序列测定表明,所克隆的hLF基因序列全长为2,136bp,与Gene Bank中登录的序列相比,同源性达99％以上．     

中国小型猪FasL的cDNA克隆及序列分析

以广西巴马小型猪活化的外周血淋巴细胞为材料，抽提总RNA，反转录成cDNA，参照人FasL基因保守序列设计引物，扩增得到包括全长阅读框序列的特异性DNA片段，将其克隆于T-vector，以双脱氧法完成测序，在国际上首次完成中国小型猪FasL基因序列（GenBank登录号：AY033634），该序列全长846bp，编码282个氨基酸的CD95L分子，为Ⅱ型膜蛋白，其膜内部分含脯氨酸残基，通过比较分析发现，小型猪与人FasL基在的核苷酸序列同源性为87%，氨基酸序列同源性为88%，比人的FasL基因多一个氨基酸，这些数据将为进一步用小型猪作为实验动物进行生物学和免疫应答研究提供必要的资料。     

人锰超氧化物歧化酶cDNA基因的克隆

利用人胚胎肝组织提取总ＲＮＡ,从总ＲＮＡ 中分离纯化出ｍ ＲＮＡ,经逆转录得到ｃＤＮＡ 第一条链,并以之为模板和相应寡聚脱氧核苷酸为引物,进行ＰＣＲ 合成人锰超氧化物歧化酶ｃＤＮＡ 基因,将所得ｃＤＮＡ 克隆到质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ 上,转化大肠杆菌ＤＨ５α细胞,进行诱导表达筛选,将筛选的克隆进行ｃＤＮＡ 全序列测定     

中国人HLA-G1的cDNA克隆、序列分析、表达和蛋白质空间结构预测

从中国人外周血单个核细胞、胎盘组织和肝癌组织等样品中克隆了包含完整HLA-G1读框的cDNA;与国外同行获得的该基因及其蛋白质序列比较分析表明,该基因虽然有着细微的种族特异性,但高度保守;并获得了它的截断型重组蛋白,根据蛋白一级结构和同源比较方法,模建了它及其与特异性受体KIR2DL4形成复合体的空间结构模拟,预测了它们之间相互作用的特征.     

从噬菌体展示七肽肽库筛选α-淀粉酶特异性配体

为了建立蛋白质亲和配基的高效筛选方法，以淀粉酶为靶分子，利用交替洗脱法从七肽噬茵体展示库中筛选具有高亲和力的噬茵体配体．结果表明，交替洗脱法筛选出的特异性配体的回收率和ELISA信号值均优于酸洗脱法；采用交替洗脱法能够更加有效和迅速地筛选到淀粉酶的高亲和力配体．分析筛选得到的不同噬茵体克隆DNA插入片断的氨基酸序列，发现了可能与配体高亲和性有关的氨基酸残基．     

SARS病毒的S1蛋白基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立

为了建立方便、敏感和特异的SARS病毒血清学诊断方法,利用PCR扩增,克隆了SARS冠状病毒S蛋白基因中从第68～918位碱基的基因序列(S1蛋白).并通过pGEX-4T1表达系统在大肠杆菌BL21中高效表达了SARS病毒S1蛋白,用超声波破碎菌体及用不同浓度的尿素洗涤包涵体,纯化了S1蛋白,纯度可达75%以上.以在E.coli高效表达的S1蛋白为抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG为二抗,建立了检测SARS抗体的间接ELISA方法.经检测,筛选出最佳反应条件为5μg/孔.用纯化的E.coli表达的抗原包被酶标板,用5 g/L的小牛血清进行封闭,以正常E.coli裂解上清液稀释待检血清.实验表明,应用表达的蛋白作为诊断SARS抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点.