大鼠CRMP1基因siRNA的筛选

目的:筛选有效抑制大鼠CRMP1基因表达的siRNA序列.方法:化学合成3对针对大鼠CRMP1基因的特异性siRNA,用脂质转染胺(lipofectamine)LTX转染大鼠海马神经元,通过流式细胞仪检测转染效率,使用RT-PCR与实时 PCR检测CRMP1基因mRNA的表达,从而筛选抑制效率最高的siRNA.结果:流式细胞仪检测转染效率为52.5%.通过RT-PCR的初步检测和实时 PCR的定量检测结果显示,与对照组相比,所设计的3对siRNA均能不同程度抑制CRMP1基因mRNA的表达,其中CRMP1-249 siRNA抑制效果最佳,抑制率达84.3%.结论:成功筛选出1对能有效抑制大鼠CRMP1基因表达的siRNA序列.     

小鼠海马神经元急性分离和膜片钳技术的应用

为了获得适用于膜片钳实验技术的单个海马神经元,应用酶消化及机械分离法,急性分离出生10～13d的昆明小鼠得到单个海马神经元通过倒置显微镜直接观察和全细胞膜片钳技术分别对分离得到的海马细胞的形态学和电生理学特征进行研究．通过实验可得,急性分离所得活性较好的海马神经元胞体具有锥形胞体和顸树突特征,立体感强．在全细胞膜片钳记录模式下可记录到全细胞电流及钠、钾通道电流．由实验结果可知,该方法可以得到形态和生理特征良好的单个海马神经元,证实该方法适用于膜片钳技术的研究,对深入探讨药物、物理因子等对海马离子通道及信号转导机制的作用有重要的应用价值．     

电场对中间神经元亚线性树突整合的调制作用

中间神经元的树突形态大多呈现出空间对称性分布,使得电场在其胞体附近引起的膜电位极化作用微弱,因此大多数研究认为电场对中间神经元难以产生调制作用.然而,电场在中间神经元末端的树突棘位置能够诱发较强的膜电压极化效应,远端的树突极化是否以及如何影响中间神经元的树突整合特性尚不十分清楚.为此本文针对分散和集中空间分布的AMPA类型突触输入,研究了电场对中间神经元全局和局部亚线性树突整合特性的调制作用.为了描述电场作用下树突对AMPA突触输入积分的潜在规律,首先建立了描述中间神经元输入-输出关系的简化电路模型,此模型具有多个被动树突分支且以不均匀细胞外膜电势表征电场诱发的极化效应;其次,基于奇异摄动理论分析了电场调节下的亚线性树突整合的动力学特性,推导出了可描述局部和全局树突整合的阈下输入-输出关系的渐近解析表达式.理论分析结果表明,电场通过改变AMPA突触输入的驱动力调节中间神经元局部以及全局亚线性树突整合特性,调制效应依赖于电场对远端树突的极化程度.相比于局部树突整合,电场对全局树突整合调制更敏感.最后,利用电场作用下具有真实树突形态的海马CA1区中间神经元模型仿真验证了理论分析结果.     

增塑剂DEHP暴露对青春期小鼠社会行为的影响

为探讨邻苯二甲酸二乙基己酯(di-ethylhexyl phthalate,DEHP)对青春期小鼠社会行为的影响.以旷场行为、高架十字迷宫、强迫游泳等行为模型实验检测小鼠焦虑抑郁行为,western blot实验检测雄激素受体(androgen receptor,AR)、多巴胺转运体(Dopamine transporter,DAT)、多巴胺受体(dopamine receptor 2,D2)的表达水平,激光共聚焦显微镜观测离体培养海马神经元的树突形态.研究结果表明:青春期DEHP暴露降低小鼠脑和血清雄激素水平,减少社会探究和社会交互能力,加剧焦虑抑郁状态;纹状体脑区多巴胺受体D2和雄激素受体AR水平下调;抑制神经元树突发育.总之,青春期DEHP暴露会抑制小鼠的社会行为,加剧其焦虑抑郁情绪,脑内雄激素和多巴胺递质系统活动及神经元树突形态的改变可能与此有关.     

新型tacrine双联体对培养大鼠海马神经元NMDA受体作用位点的研究

目的：研究新型tacrine双联体bis（7）-tacrine对NMDA受体的作用位点.方法：大鼠海马神经元原代培养,全细胞膜片钳记录培养大鼠海马神经元上NMDA激活电流变化.结果：细胞外液pH值从8.1改变到6.7,在细胞外液中加入二硫苏糖醇（2 mmol/L）、精胺（10 mol/L）、镁离子（50～500 mol...     

SHANK2基因表达下调对诱导多能干细胞来源神经发育模型早期发育的影响

目的:探索SHANK2基因表达下调对诱导性多能干细胞神经发育模型的早期影响.方法:体外建立人诱导多能干细胞来源的神经发育模型,构建携带靶向敲减SHANK2基因表达信息shRNA的慢病毒,在发育起点感染细胞模型.在发育第3、6、9、12、15天分别固定细胞,荧光显微镜拍照,动态监测继发于SHANK2表达下调的胞体面积、突起长度与分支、生长锥面积等神经元形态发育变化.结果:体外成功建立人诱导多能干细胞来源的神经发育模型.与sh Control组相比,在发育不同时间点shSHANK2组神经元分支个数减少、突起长度减小,shSHANK2组神经元胞体面积、生长锥面积均有所减小.结论:SHANK2基因敲减导致早期神经元形态发育异常,可能是SHANK2导致自闭症谱系障碍的潜在致病机制之一.     

甘氨酸对大鼠前额叶皮质锥体神经元串连动作电位影响的研究

目的:研究甘氨酸对大鼠前额叶皮质锥体神经元串连动作电位的影响。方法:大鼠前额叶皮质切片,全细胞膜片钳记录锥体神经元串连动作电位。结果:甘氨酸(300μmol/L)可显著降低大鼠前额叶皮质锥体神经元串连动作电位的发放频率,其作用可被番木鳖碱(1μmol/L)所阻断,表明其作用部位为番木鳖碱依赖性甘氨酸受体。甘氨酸还引起膜超极化,延长动作电位的潜伏期,加快复极化进程。结论:前额叶皮质的甘氨酸受体可能在VTA-NAcc-PFC神经环路的调控中发挥重要作用。     

依托咪酯对腹外侧视前区神经元GABA能传递的抑制作用

目的:研究依托咪酯对大鼠腹外侧视前区神经元γ-氨基丁酸能传递的影响。方法:大鼠腹外侧视前区切片,全细胞膜片钳记录神经元抑制性突触后电流。结果:依托咪酯(0.1μmol/L)可逆性地降低腹外侧视前区神经元的诱发抑制性突触后电流幅度,但未能显著性改变其配对脉冲比率。依托咪酯(0.1μmol/L)作用下,自发抑制性突触后电流的频率与幅度均显著性下降,其动力学参数未受影响。结论:依托咪酯可作用于突触前及突触后γ-氨基丁酸受体而抑制对腹外侧视前区神经元的γ-氨基丁酸能传递,这一作用可能使其处于兴奋状态,进而抑制结节乳头体核的组胺能神经元,减少组胺释放而发挥麻醉镇静作用。     

坍塌反应调节蛋白2在膀胱尿路上皮癌中的表达及其与预后的相关性

目的:研究坍塌反应调节蛋白2(CRMP2)在非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌(NMIBC)中的表达及临床意义.方法:免疫组化检测130例NMIBC石蜡切片组织中CRMP2表达水平,分析其与临床病理指标的关系,通过生存分析,探讨其与肿瘤复发、进展及生存时间的相关性.单因素和多因素分析探究CRMP2是否具有独立预测作用.结果:膀胱癌组织CRMP2表达水平与肿瘤分级、复发、进展正相关(P0.05),与年龄、性别、手术方式以及肿瘤大小无明显相关性(P0.05).CRMP2高表达患者复发率、肿瘤进展率和死亡率明显高于低表达患者(P0.05).单因素分析和多因素分析显示,CRMP2是患者术后复发(P=0.021,HR:2.72,95%CI:1.97,3.39)和进展的独立危险因素(P=0.021,HR:2.99,95%CI:1.93,4.61).结论:CRMP2既是NMIBC促癌因子,又是NMIBC预后不良的独立危险因素.     

Rho激酶影响大鼠海马神经元突起生长的实时成像

目的:观察Rho激酶对大鼠海马神经元突起生长的影响.方法:体外培养新生大鼠海马神经元5 d后,连续动态观察溶血性磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)及Rho激酶抑制剂Y-27632对神经元突起生长的影响.结果:对照组神经元一级突起迅速生长、延伸,不断发分支,形成丰富的二级、三级突起;用LPA处理后,神经元大部分突起进行性塌陷,一级突起逐渐缩短并且变细,二级、三级突起数量减少,且较细小;而预先用Y-27632处理后再加LPA,细胞突起塌陷的现象减少,神经元的突起不断分支、延伸,一级、二级、三级突起数量较LPA组增多且长度也增加.结论:Rho激酶参与LPA诱导海马神经元突起回缩的过程,抑制Rho激酶的活性可抑制LPA诱导的突起回缩.     

腺病毒载体转导绿荧光蛋白表达在海马神经元树突量化分析中的应用

构建了表达绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-EGFP),并成功感染体外培养的海马神经元.结果表明:应用表达绿荧光蛋白腺病毒感染的海马神经元,结合荧光显微镜活细胞成像技术,能定量分析神经元树突发育过程的动态变化,可应用于神经元发育形态的动态研究及各种因素对神经元生长发育影响的研究.     

姜黄素对IL-6损伤的大鼠海马神经元的功能性保护作用及机制

目的:探讨姜黄素对IL-6损伤的大鼠海马神经元的功能性保护作用及其机制.方法:应用离体脑片记录技术,记录大鼠海马CA1区的兴奋性突触后电位(EPSP),给予Schaffer侧支高频电刺激(HFS)诱发长时程增强(LTP),观察不同药物处理组EPSP起始斜率的变化情况.结果:与对照组相比,IL-6和N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)对大鼠海马脑片的LTP产生明显的抑制作用(P<0.05);而姜黄素可部分拮抗IL-6和NMDA对海马脑片LTP的抑制作用,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05);IL-6、姜黄素和NMDA对大鼠海马神经元的基础突触传递无影响.结论:姜黄素对海马神经元具有功能性保护作用,其机制可能是作用于神经元细胞膜上的NMDA受体,拮抗IL-6引起神经元功能异常.     

17β-雌二醇对大鼠海马神经元钙离子水平的快速影响

探讨了17β-雌二醇(17β-E2)对体外培养大鼠海马神经元细胞内钙离子水平([Ca~(2+)]i)的快速影响及其可能的机制.大鼠海马神经元体外培养8~10 d,用Fluo 4-AM钙离子荧光探针负载胞内Ca~(2+),用激光共聚焦显微镜动态检测了17β-E2对谷氨酸诱导的神经元内Ca~(2+)荧光强度的影响.结果显示:17β-E2(10 nmol·L~(-1))处理30 min,对正常状态下神经元的[Ca~(2+)]i无显著影响,但可快速促进谷氨酸诱导的[Ca~(2+)]i增加(与对照组相比,P0.001),雌激素受体阻断剂ICI182780(10μmol·L~(-1))预处理可阻断17β-E2的这一促进作用;胞外信号调节激酶(ERKs)抑制剂U0126(10μmol·L~(-1))单独处理神经元,可极显著抑制谷氨酸诱导的[Ca~(2+)]i增加(P0.001),但这一作用可以被17β-E2部分逆转.研究结果提示,ERKs信号通路可能参与谷氨酸诱导的神经元[Ca~(2+)]i增加,17β-E2可能经雌激素受体介导的ERKs信号通路快速促进谷氨酸诱导的神经元[Ca~(2+)]i增加.     

人线粒体蛋白编码基因C2ORF47在细胞增殖与凋亡中的作用初探

线粒体在真核细胞中扮演着重要的角色,其功能障碍与许多疾病的发生密切相关.在这项研究中,我们鉴定了一个有Tim44样结构域(Tim44-like domain)的人类线粒体蛋白编码基因C2ORF47(chromosome 2openreading frame 47).该基因是从人的睾丸组织中克隆出来的,在人体各种组织中广泛表达.序列比对和进化分析表明,该蛋白质和其同系物在脊椎动物中是保守的.采用免疫荧光技术,我们发现该基因产物定位于线粒体.过表达C2ORF47可以抑制细胞增殖.使用siRNA敲减内源的C2ORF47能促进细胞增殖.此外,敲减C2ORF47会导致糖和血清饥饿引发的细胞凋亡大幅减少.总之,在细胞增殖和由饥饿引发的细胞凋亡的调控中,该基因可能发挥重要作用.     

利用CRISPR/Cas9技术构建GLUT4基因敲减的A549细胞系

目的:为探究GLUT4基因在肺癌细胞中的功能及影响.方法:在GLUT4外显子上设计了4个sgRNAs(S1、S2、S3、S4),分别与PX458载体连接形成重组表达载体后,借助转染试剂lipo3000将表达载体转入生长态势良好的A549细胞中,再利用流式细胞仪分选技术对转入重组载体发出绿色荧光的细胞进行单细胞分选.利用基因组测序筛选突变株,提取突变株的RNA和蛋白,进行Real-time PCR及Western Blot检测敲减效率,并利用激光共聚焦显微术检测突变株葡萄糖摄取量的变化.结果:突变株细胞在mRNA及蛋白水平均表现出GLUT4基因敲减效果,并在葡萄糖摄取上表现出明显的降低趋势.结论:利用CRISPR/Cas9系统成功建立了GLUT4基因敲减A549细胞系.     

多巴胺对海马神经元树突和突触形态的调节作用

为探讨多巴胺(dopamine,DA)对海马神经元树突和突触形态的影响及其机制,用体外培养10 d的海马神经细胞DA(0.1μmol/L～10 mmol/L)处理1 h,用绿色荧光标记突触前Syn1,红色荧光标记树突上F-actin,分别显示突触前和突触后树突棘位点,红绿色叠加的黄色区域标示突触.结果表明:1～100μ...     

柴胡-白芍对抑郁大鼠海马神经递质的影响

通过观察柴胡-白芍药对治疗抑郁模型大鼠海马中枢神经递质变化及BDNF和Trk B表达的情况,探讨其抗抑郁症的机理.采用HPLC法测定海马组织单胺类神经递质5-HT(5-羟色胺)、NE(去甲肾上腺素)、DA(多巴胺)的质量比.采用免疫组化法检测海马中BDNF(海马脑源性神经元)和Trk B(受体型酪氨酸蛋白激酶)阳性神经元面密度值的变化.结果表明,与模型组比较,柴胡白芍药对高、中剂量组海马单胺类神经递质5-HT,NE和DA质量比均显著增加,差异均有统计学意义(P0.05或P0.01);上调BDNF和Trk B阳性神经元面密度值(P0.05或P0.01).其作用机制可能是提高大鼠脑内海马组织和皮质组织NE、5-HT、DA质量比及上调BDNF(海马脑源性神经元)和Tr KB(受体型酪氨酸蛋白激酶)的表达.     

虫草素改善脑缺血小鼠学习记忆及对海马神经元数量的影响

采用双侧颈动脉夹闭建立脑缺血模型,观察造模后和造模前腹腔注射100 mg/kg虫草素对小鼠Y迷宫行为训练的影响,以及检测海马各区神经元数量的变化.结果表明,造模前给予虫草素能明显提高小鼠的正确反应率(P<0.05),减少达标所需训练次数(P<0.05),显著增加海马CA1区和CA3区锥体神经元数量(P<0.01).造模后给予虫草素显著减少小鼠达标所需训练次数(P<0.05);同时,海马CA3区神经元数量显著增加(P<0.01).由此可见,虫草素能改善脑缺血小鼠的学习能力,预防作用比治疗作用更为显著,可能与虫草素促进海马神经元的修复有关.     

白术内酯Ⅲ对痴呆大鼠学习记忆能力及海马Bcl-2表达的影响

采用大鼠双侧侧脑室注射Aβ1-42建立老年痴呆动物模型,通过Morris水迷宫行为实验、海马乙酰胆碱酯酶(AChE)活性生化测定及海马凋亡抑制基因Bcl-2表达Western Blot检测,研究了白术内酯Ⅲ(AtractylenolideⅢ,ATLⅢ)对痴呆大鼠学习记忆能力的影响.结果表明:与模型组相比,ATLⅢ中、高剂量组的逃避潜伏期显著缩短(P0.01),在原平台象限的停留时间显著延长(P0.01),海马AChE活性显著降低(P0.05),Bcl-2表达显著增高(P0.05,P0.01).结果提示白术内酯Ⅲ可显著改善痴呆大鼠的学习记忆能力,其机制可能与抑制AChE活性及上调海马Bcl-2基因的表达有关.本研究对于神经保护作用药物的开发具有重要的临床意义.     

β-淀粉样蛋白31-35及25-35片段对海马CA1细胞兴奋性和抑制性受体通道电流的影响

在Alzheimer病(AD)出现神经变性前的早期记忆功能障碍中,可溶性β-淀粉样蛋白(Aβ)发挥了重要作用.Aβ及其活性片段对海马长时程增强(LTP)的压抑效应与其对学习记忆认知行为的伤害作用具有密切联系,但其机制仍不清楚.鉴于突触后兴奋性和抑制性受体/通道在突触传递、包括LTP的诱导中起着关键性调制作用,利用全细胞膜片钳技术观察了β-淀粉样蛋白31-35片段(Aβ31-35)和25-35片段(Aβ25-35)对急性分离的海马CA1区锥体细胞谷氨酸(Glu)受体、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体和γ-氨基丁酸(GABA)受体通道电流的影响.结果显示:急性给予Aβ25-35或Aβ31-35可对Glu受体电流和GABA受体电流产生相反的调制作用.Aβ25-35预处理剂量依赖性地减小了Glu和NMDA引起的全细胞内向电流,相反,GABA受体电流被明显增强;小片段的Aβ31-35也选择性抑制了Glu和NMDA受体电流,增强了GABA受体电流;然而,给予Aβ25-35的反序列Aβ35-31预处理后,Glu,NMDA和GABA引起的受体电流均未出现明显改变.这些结果表明,Aβ25-35和Aβ31-35片段急性处理可导致海马锥体细胞NMDA受体和GABAA受体分别受到抑制和易化影响,这可能有助于解释AD早期可溶性AB对海马LTP及认知行为造成的伤害作用.同时,Aβ25-35Aβ31-35片段具有的类似效应提示,31-35序列很可能是Aβ发挥神经毒性作用的活性中心.