苏云金杆菌4.0718菌株InhA的鉴定和不同生长时期的表达分析

免疫抑制因子A (Immune Inhibitor A, InhA)是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)分泌的一种锌金属蛋白酶,具有水解昆虫抗菌肽的活性.为了研究InhA在Bt 4.0718菌株中的重要功能,利用SDS-PAGE分离了Bt 4.0718菌株营养生长中期、芽胞早期和芽胞晚期的细胞总蛋白质,通过MALDI-TOF/TOF MS分析以及数据库搜索,鉴定到了相对分子质量为86.5kD、pI为5.37的InhA蛋白质.然后采用双向电泳(2-DE)技术检测该蛋白质在不同时期表达量的差异,发现分离和鉴定到的InhA及相对分子质量为75kD、pI为5.13的InhA precursor蛋白质在营养生长中期的表达量比较高,说明InhA在营养生长中期前已开始形成,直到芽胞早期达最大表达量,但芽胞晚期的图谱分析和质谱鉴定均未发现InhA. InhA在营养期的高效表达说明:Bt进入昆虫体内后,InhA在Bt细胞生长繁殖初期表达,并抑制昆虫体内的抗菌肽对Bt细胞的裂解作用,从而有助于Bt在昆虫宿主中的生存,为芽胞期晶体和芽胞的形成以及菌株毒力的发挥奠定了基础.     

苏云金芽孢杆菌伴孢晶体中20-kb DNAs上染色体基因的鉴定

已有的研究表明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4.0718菌株菱形晶体中含有与原毒素紧密结合的20-kb DNAs,利用PCR-RFLP分析发现在这些20-kb DNAs上含有cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa和cry2Ab基因.本研究利用特异引物从4.0718菌株中20-kb DNAs上分别扩增出带有自身调控序列的cry1Ac和cry2Aa基因,并将其分别电转至Bt无晶体菌株Cry-B中获得重组菌株Cry-B(pHC42)和Cry-B(pHC39).SDS-PAGE和透射电镜分析表明这两种重组菌株能够分别产生由130-kDa的Cry1Ac原毒素形成的菱形晶体以及由65-kDa的Cry2Aa原毒素形成的方形晶体.毒力生测的结果显示,这两种菌株的表达产物对棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫具有预期的杀虫效果.重组菌株分别形成的两种晶体经不同的缓冲液溶解后能释放出与20-kb DNAs紧密结合的原毒素,同时在20-kb DNAs上均可检测到源于Bt染色体的spo0A和nprA基因片段.     

昆虫也会搞“窃听”

情报在战争中的作用不言而喻，而美国科学家最近发现，在植物与昆虫的“战争”中，昆虫也会“窃听”植物发出的求救信号，提早做好准备，应付植物即将采取的防御计划。植物被昆虫啃食时，会产生一些化学物质，一是吸引这些昆虫的天敌来捕食昆虫，二是告知植物自身防御系统加强“军备”，制造对昆虫有毒的物质。例如芹菜被美洲棉铃虫的幼虫啃食时，会产生茉莉酮酸酯和水杨酸酯等化学警报信号，促进植株内毒素的合成。研究人员发现，美洲棉铃虫幼虫会“截获”这些信号，在植物产生毒素前，棉铃幼虫体内有４个称为“细胞色素P４５０”的基因会…     

动物Trypsin基因结构、表达及应用研究进展

胰蛋白酶广泛存在于各类动物体内,是动物生长发育中不可缺少的一类催化蛋白质水解的酶.作为动物细胞内重要的水解酶,胰蛋白酶在自身活化以及激活胰分泌的其它蛋白酶类方面起关键作用,一般认为胰蛋白酶的活性与其结构和特性紧密相关.对近年来国内外主要动物胰蛋白酶的作用机理、基因、酶蛋白的氨基酸组成、结构及重组胰蛋白酶的表达等最新研究进展进行了综述,并展望了胰蛋白酶今后的研究发展方向.     

如何防治转Bt基因棉害虫

<正> 1.加强监测。要特别注意监测转Bt基因棉没有抗性的棉蚜、棉盲蝽、棉红蜘蛛等害虫,及时掌握发生的虫情进行防治。棉铃虫随着棉株的生长,毒杀作用降低,要特别注意三、四代棉田幼虫存活量。一般掌握棉田百株三龄幼虫达10-15头时,应及时施药防治。 2.保护天敌。由于转Bt基因棉棉田施药次数减少,害虫天敌种群增加,化防时要选用对天敌杀伤力小的蚍虫啉、虫螨克、     

一株枯草芽胞杆菌的分离鉴定及其杀虫活性的研究

以从土壤中自行分离的219株芽胞杆菌中筛选的一株枯草芽胞杆菌菌株HX08为研究对象,通过菌落形态观察、扫描电镜、激光共聚焦显微镜等进行菌体形态观察以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鉴定,该株细菌属枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis,命名为HX08,并将其16S rRNA基因序列提交上Genebank数据库,获得登陆号KF774302.通过生测发现,HX08菌株在60 h发酵时间段对棉铃虫的致死效果最好.对该菌株发酵液提取的活性蛋白进行初步研究,建立了HPLC技术分离体系,使用H2O做流动相,以0.5 mL/min流速洗脱,检测波长分别为215、254和280 nm,收集第15 mL收集管处即保留时间为31 min的2号峰粗分离物活性较高.切取SDS-PAGE胶上相对应活性峰目的蛋白质条带酶解,利用质谱(LTQ-MS)技术进行了分子特性分析,鉴定发现杀虫活性蛋白成分为草酸脱羧酶.     

两种取食刺激物对AcNPV和Bt增效的作用

取食刺激物使害虫幼虫在初期摄入更多的活性成分能提高病毒感染效果.室内以蜂蜜和新鲜小白菜汁分别添饲银纹夜蛾幼虫;测定了其对AcNPV和Bt的增效作用,结果表明:在中低浓度AcNPV时,蜂蜜和新鲜小白菜汁液刺激银纹夜蛾幼虫初期取食,其感染后前3 d的粪便量比只有AcNPV处理的增加34.51%～79.60%,幼虫死亡率提高8.89%～13.33%,LT50缩短1.4～2.7 d.蜂蜜提高了Bt对银纹夜蛾幼虫的死亡率,但死亡速度未见明显加快.     

苏云金芽胞杆菌cry7Ab9基因的克隆与杀虫活性的测定

以辽宁省千山市的22株苏云金芽胞杆菌进行PCR cry型的cry7类基因鉴定,对cry7类基因进行克隆表达及生物活性测定,为cry基因储备奠定基础.菌株QZG121经比对后发现含有cry7Ab基因.克隆该基因全长序列为3 417 bp,编码1 138个氨基酸残基,相对分子质量为130 000,并在Gene Bank中登记,基因登录号为GU936713,由苏云金芽胞杆菌国际命名委员会正式命名为cry7Ab9.通过构建原核表达系统获得cry7Ab9基因表达蛋白,并进行暗黑鳃金龟幼虫杀虫活性的测定,7天校正死亡率10 mg.L-1为11.11%、100 mg.L-1为25.93%;两周校正死亡率10 mg.L-1为33.33%、100 mg.L-1为48.15%,LC50为289.99 mg.L-1.     

新型蛋白酶抑制剂基因hwtx-11在大肠杆菌中的克隆表达及杀虫功能研究

将化学合成的蜘蛛毒素蛋白酶抑制剂基因hwtx-11克隆至载体pGEX4T-1上,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.重组菌株在IPTG诱导下,经SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达的GST-HWTX-11融合蛋白的相对分子量约为33 kD.对重组菌株诱导表达后的产物进行生物活性测定,GST-HWTX-11融合蛋白对甜菜夜蛾(Spodoptera exiguaHubner)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)在3d时的LC50分别为86.6μg/mL、119.4μg/mL;其与Cry1Ac对甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫毒力也有明显的协同作用.     

抗虫棉种植的误区及措施

提个醒 抗虫棉就是利用基因工程，将苏云金杆菌中能够产生有毒蛋白质的基因导入棉植株内，选育成具有杀死棉铃虫等鳞翅目害虫的棉花品种。在引种过程中，有些棉农误称它为无虫棉或无病棉，误认为这种棉花不生病。不生虫，不需要打药防治，可以随便种植，从而造成棉花反遭虫灾减产。事实上，抗虫棉仅对棉铃虫等鳞翅目害虫有抗性，幼虫在三龄前因取食棉株器官后中毒而死。对其它害虫及病害没有特殊抗性。同时，抗棉铃虫是相对的，对三龄后的大龄幼虫抗性较差，因此田间仍会不同程度残存着棉铃虫。所以，在栽培中仍需加强田间管理。 做到：１．…     

地热田碱性蛋白酶菌株的选育与酶性质的研究

从温泉附近土样中成功分离到一株高温碱性蛋白酶产生菌株H-1,经初步鉴定为芽孢杆菌（Bacillus.）菌株H-1最佳产酶的发酵时间为67.5h,该酶在30～70℃酶活性随温度升高而增强,70℃酶活性达到最高,在pH7.0～11.0范围内较稳定,从菌株H-1液体发酵液中提取粗酶液,经CMC-I阳离子交换层析和SepHadex G-75凝胶层析,得到单一组分;通过Native-PAGE、SDS-PAGE电泳鉴定,粗酶至少含有3种碱性蛋白酶同工酶;单组分碱性蛋白酶的比活力为3875U,相对分子量约为31KDa.     

浒苔水溶性多糖的酶法脱蛋白工艺研究

选用反应温度、时间、pH、蛋白酶质量分数4个因素进行单因素多水平试验,在此试验的基础上,按L9(34)正交法,设计正交试验.4个因素对酶解法脱蛋白的影响程度为:pH温度酶加入量时间;最佳酶解脱蛋白工艺条件为:酶解温度50℃、时间2.5 h、pH6.5、酶加入量0.200 g(19.671×10-7 mol/s.mg-1).     

干燥环境下爆炸伤的细菌学变化分析

探讨了干燥环境下爆炸伤细菌定量变化及感染发生．采用三元品种猪制作干燥环境下的爆炸伤模型,对伤后4h、7h、9h、12h、16h、24h、48h进行创面观察、血中白细胞计数、细菌计数、细菌鉴定及药敏测定分析．其结果表明：爆炸伤后24h创面细菌数量可达（5．64＋0．20）×10^6／g组织,白细胞数可达（23．43＋3．93）×10^9／L,创面组织出现炎症症状,清创后每克组织细菌数量增加速度减慢．爆炸伤创面细菌种类多,细菌对青霉素、四环素、红霉素及复方新诺明表现耐药性,对三代头孢菌类和喹诺酮类药物敏感．干燥环境下爆炸伤的清创时间可适当延长,可在伤后16h内进行清创．     

紫外线辐射对水螅三种保护酶活性的影响

用波长为365 nm的4 W紫外线灯照射水螅,50 min时水螅全部死亡,LD50=26 min.紫外线灯照射对水螅超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)影响显著.在水螅恢复的过程中三种酶活性开始阶段均有不同程度的提高,SOD 16 h后、POD和CAT 24 h后酶活力分别逐渐下降.说明水螅在抗紫外线的修复过程中保护酶起到了一定的作用.     

Pb~(2+)和Cu~(2+)对水螅的急性毒性作用以及对SOD活性的影响

采用急性毒性实验方法研究了不同质量浓度的Pb2+和Cu2+对水螅急性毒性作用(LC50),并且测定了经Pb2+和Cu2+胁迫后水螅体内SOD的变化.结果表明,2种重金属离子毒性大小顺序为Cu2+Pb2+.Cu2+和Pb2+对水螅24,48,72,96h的LC50分别为0.33,0.28,0.24,0.22mg/L和2.17,2.05,1.58,1.04mg/L,其安全质量浓度分别为0.022mg/L和0.104mg/L.通过0.6,0.7mg/L的Pb2+溶液对水螅SOD的24h实验起抑制作用,与对照组相比,SOD活性急剧下降,变化显著(P0.05);0.7,1.5,2.0mg/L的高质量浓度溶液对水螅SOD活性基本上没有变化.通过0.15,0.20,0.25,0.30,0.35mg/L的Cu2+溶液对水螅SOD的24h实验起诱导作用,水螅的SOD活性基本上呈上升趋势,在质量浓度为0.30~0.35mg/L的范围内,SOD活性急剧上升,与对照组相比,变化显著(P0.05).     

油菜种子中预存mRNA的转译活性

对油菜种子中预存ｍＲＮＡ的研究表明，油菜种子中存在预存的ｍＲＮＡ。在油菜种子萌发时，预存ｍＲＮＡ能够转译淀粉水解酶和蛋白水解酶，但不能转译Ｎａ＾＋－Ｋ＾＋ＡＴＰ酶。     

ICR小鼠肥胖过程中基础代谢率的变化

用高脂饲料饲喂ICR小鼠 ,建立饮食性肥胖模型 ,对实验过程中实验组和对照组动物的相关指标进行比较 .结果表明 :实验组小鼠的摄食量、体质量、Lee’s指数及体脂含量均显著高于对照组 ;实验组小鼠基础代谢率显著低于对照组 .高脂饲料可诱导小鼠产生饮食性肥胖 ,饮食性肥胖与小鼠的高摄食效率及代谢率改变密切相关 .     

已烯雌酚对蝌蚪抗敌敌畏诱导氧化损伤的作用研究

研究已烯雌酚（DES）对中华大蟾蜍（Bufobufo gargarizans）蝌蚪抗敌敌畏（0,0-二甲基-0-（2,2-二氯乙烯基）磷酸酯,DDVP）诱导的氧化损伤的作用．方法：蝌蚪（30～35期）随机分为5组：I（0mg／LDDVP＋0mg／LDES）为空白组;Ⅱ（12．9mg／LDDVP＋0mg／LDES）为单独DDVP处理组;Ⅲ（12．9mg／LDDVP＋1．0mg／LDES）;1V（12．9mg／LDDVP＋2．0mg／LDES）;V（12．9mg／LDDVP＋3．0mg／LDES）为DDVP和DES联合处理组．在染毒24h和72h时测定蝌蚪肝组织中超氧化物歧化酶（SoD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性以及丙二醛（MDA）的含量,计算抗氧化指数．其结果在DDVP（12．9mg／L）存在的条件下,随着DES（1．0mg／L）的加入和浓度的依次加大（2．0mg／L,3．0mg／L）,SOD活性呈下降趋势,72h时具显著性（P〈0．05）;GSH—Px活性呈先升高后降低的变化趋势,在24h和72h均具极显著性（P〉0．01）;MDA含量呈先降低后升高的变化趋势,72h时具显著性（P〈0．05）。其中联合处理组Ⅲ的抗氧化能力最强．结论：DES对DDVP诱导的氧化损伤作用具有拮抗效应,能有效地增强中华大蟾蜍蝌蚪的抗氧化能力．     

高产碱性蛋白酶工程菌的构建及鉴定

利用原生质体融合技术，使碱性蛋白酶生产菌2709与枯草杆菌BD105(含有碱性蛋白酶基因克隆载体pDW2)杂交，得到1株高产碱性蛋白酶的工程菌A16．A16的表型与生长特征与2709相似，相同条件下发酵酶活性比2709菌株高50％，摇瓶发酵的产酶水平最高可达30000u／mL。用菌落的原位杂交鉴定出该菌株携有双亲的遗传物质．     

两种生物农药对蚯蚓的急性毒性及氧化胁迫效应

为探究植物性杀虫剂鱼藤酮、藜芦碱对蚯蚓的影响选择赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)为受试生物,通过急性毒性实验和抗氧化酶活性测定,揭示鱼藤酮、藜芦碱的毒性效应。结果显示,急性染毒试验鱼藤酮对蚯蚓24h、48h的半致死质量浓度分别为23.96mg/L、5.991mg/L,藜芦碱对蚯蚓24h、48h的半致死浓度分别为40.67mg/L、20.33 mg/L。说明藜芦碱、鱼藤酮对蚯蚓有致死效应,鱼藤酮的毒性强于藜芦碱;蚯蚓体重的增长受到了药物浓度的影响,有较明显的剂量效应关系,但随时间的延长对蚯蚓体重的抑制效应减弱;在药物胁迫下,SOD与POD活性变化随质量浓度增大呈现先上升后下降,蚯蚓体内SOD、POD响应不同,POD对药物响应更敏感。