草鱼椎骨间质细胞系对水生动物病毒敏感性的测定

取草鱼椎骨间质组织体外培养,连续传代超过30次,建立了呈上皮细胞形态的草鱼椎骨间质细胞系GCVB.将自鳖、蛙、鱼中分离到的10株病毒分别接种于长成致密单层的GCVB细胞中,显微观察细胞病变情况,测定病毒滴度.结果表明,GCVB细胞对不同病毒株敏感性不同,如对鳜鱼病毒SCSV和虹鳟传染性胰腺坏死病病毒IPNV不够敏感,仅引起轻微或不可察病变,病毒滴度低于10 1 TCID 50 /mL;但中华鳖病毒TSV,蛙虹彩病毒中国分离株RGV9506,蛙虹彩病毒美国分离株FV3,胭脂鱼弹状病毒CSRV,鲤春病毒血症病毒SVCV,草鱼出血病病毒GCHV89/24,以及GCHV33/86这7个病毒株,可引起GCVB细胞产生不同程度病变,滴度在10 1.8 ～10 4.3 TCID 50 /mL之间;草鱼出血病病毒GCHV873可引起GCVB细胞产生显著病变,滴度高达10 7.5 TCID 50 /mL.表明新建的草鱼椎骨间质细胞系GCVB对已测的10株水生动物病毒中的80%敏感,可用于检测、分离其他未知水生动物病毒.     

逆转录聚合酶链式反应中dsRNA模板的快速制备

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测草鱼出血病病毒。建立了一种快速，简易而可靠的ｄｓＲＮＡ模板的制备方法。应用该方法制备模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，可以有效地检测出病鱼组织及病毒感染的培养细胞裂解液中的草鱼出血病病毒，且全过程只需３－４ｈ，大大缩短了检测时间。     

RT—PCR检测草鱼呼肠孤病毒的方法研究

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）为草鱼出血病的病原．本实验根据GenBank中GCRV和其他水生呼肠孤病毒毒株的第六基因片段,在其保守区设计了一对GCRV特异性引物,建立了快速检测GCRV的逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法．该PCR体系中,上下游引物的最适终浓度为120nmol／L,最适退火温度为52℃．PCR特异性试验表明：所设计的引物只能扩增GCRV的核酸,而不能扩增嗜水气单胞菌BSK-10、WSSV以及正常CIK细胞的DNA或RNA．敏感性试验表明,当GCRV的反转录模板稀释至5-7时,PCR结果还为阳性．用所建立的RT—PCR方法对5份样品进行检测,结果表明本研究建立的RT—PCR检测方法可靠且可行．     

石河子一串红花叶病病原的分子鉴定

为了防治石河子一串红花叶病,采用提取dsRNA/RNA、RT-PCR、克隆和序列分析对病原进行了检测鉴定。结果表明:从表现花叶的S4分离物中提取dsRNA,得到大小约4700和6300 bp的片段,以此dsRNA为模板,用蚕豆病毒属(Fabavirus)的兼并引物进行RT-PCR,扩增得到1条约390 bp片段特异性条带,序列测定该片段大小为391nt,blast比对分析与蚕豆萎蔫病毒2号(BBWV2)的同源性最高,表明S4分离物为BBWV2。RNA1基因组全序列测定及分析结果表明,基因组大小为5957nt(不含poly A),仅编码1个开放阅读框(ORF),与已报道BBWV2的RNA1序列同源性为78.4%-100.0%。     

1999年春季东山九孔鲍暴发性病害研究

对 １９９９ 年春季福建省东山县九孔鲍的暴发性流行病进行调研和检测,对细菌性病原进行分离纯化、回归感染确定致病原、对致病菌进行形态（包括电镜和光镜观察）和生理生化鉴定;对病毒性病原进行电镜负染和超薄切片观察、以及病理变化分析．结果表明引起此次东山养殖九孔鲍暴发性流行病的主要致病原是 ３ 种球状病毒（５０ ｎｍ 、１１０ ｎｍ 、１５０ ｎｍ ）、溶藻弧菌和副溶血弧菌．还探讨了这些病菌和病毒的致病性,并以 ４９ 种药敏纸试验寻求防治的有效药物．     

圈养麋鹿疱疹病毒感染的诊断

为了查找北京动物园饲养麋鹿发病死亡的原因,采用临床病理学、免疫组织化学、电镜观察、PCR扩增技术等方法进行病原查找和鉴别,并进行综合判定.结果发现:1在病变组织中没有分离到致病细菌;2在经免疫组织化学反应的肝脏细胞浆内观察到少量的棕色颗粒;3在肝脏、脾脏、肾脏组织细胞中均见有直径约150~200 nm的圆形带囊膜的病毒样粒子;4经PCR方法鉴定该病毒属于疱疹病毒.根据检测结果,结合临床病理变化,确诊本次麋鹿是因感染疱疹病毒发病死亡.     

猪流行性腹泻病毒变异株的分离鉴定及其S基因序列分析

为分析山东省2016年上半年猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株变异情况,用Vero细胞从仔猪临床腹泻样品中进行病毒分离,通过细胞病变(CPE)观察、聚合酶链式反应(PCR)方法、免疫荧光(IFA)试验、电镜观察、动物回归试验和测序分析,分离鉴定1株PEDV毒株(SDMY1401株).将该毒株进行S基因序列分析和遗传进化分析,结果表明该毒株为PEDV流行变异株.该毒株S基因核苷酸序列与山东省分离株CH-SDZC-2015和河南省分离株CHHNAY-2015同源性最高为99.4%,与疫苗毒株CV777同源性为94%.遗传进化分析表明该毒株与经典毒株DR13、疫苗毒株CV777及以前国内分离毒株在不同分支.     

猪2型圆环病毒福建析的全基因组克隆与序列分析

根据已发表猪2型圆环病毒PCV2序列设计两对特异性扩增引物对福建龙岩市某规模化猪场疑似PCV2感染病例进行PCV2的检测与全基因组克隆,经测序与序列拼接,获得了PCV2福建株全基因组序列PCV2-LY.序列分析结果表明,PCV2-LY全长1767 bp,与国内外各分离株同源性在95.1 %-98.0%之间,ORF1氨基酸同源性在97.1%-99.6%之间,而ORF2氨基酸同源性在92.7%-99.1%之间     

草鱼病理学研究Ⅲ．草鱼出血病苹果酸脱氢酶（MDH）同工酶相对活性的变化

采用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳方法，研究了正常草鱼和患出血病草鱼的肾脏、肝脏、脾脏、心脏、鳃、肌肉以及血清中的苹果酸脱氢酶（ＭＤＨ）同工酶。结果表明，患病草鱼和正常草鱼各组织器官及血清中的ＭＤＨ同工酶酶谱均为６条带，患病鱼的酶谱明显地不同于正常鱼的酶谱；ＭＤＨ同工酶的活性具有组织和器官的特异性，同一组织及器官，患病草鱼ＭＤＨ同工酶的总活性较正常草鱼偏高，其中鳃、肝脏、脾脏以及血清中的ＭＤＨ同工酶总活性具有显著性差异（ｐ＜０．０５）；同种组织及器官，患病草鱼的ＭＤＨ同工酶的相应组分，活性序列产生了较大的差异；ＭＤＨ同工酶可以作为草鱼患出血病的一个生理、病理指标。     

兔葡萄球菌病的诊断和药敏试验

目的对家兔发病死亡的原因进行诊断。方法对病死家兔进行剖检观察,并进行细菌分离培养与生化鉴定、PCR检测和药敏试验。结果通过对病死家兔进行剖检观察、细菌分离培养、生化鉴定、血清学试验、PCR检测和药敏试验,确诊病死家兔是金黄色葡萄球菌感染引起的细菌性疾病。药敏试验结果表明,分离菌株对青霉素、氨苄西林、万古霉素等抗生素敏感,而对头孢他啶、呋喃妥因已产生耐药性。结论为金黄色葡萄球菌病原鉴定与疾病诊断提供了科学依据。     

利用线粒体 DNA Cytb 基因 PCR-RFLP 分析方法鉴别青鱼和草鱼

建立了一种以线粒体细胞色素 b（Cyt b）基因为标靶,应用 PCR -RFLP 技术进行草鱼和青鱼种质鉴定的分析方法。设计一对引物 QYCYT -S 和 QYCTY -A 分别对青鱼和草鱼的 Cyt b 基因进行了 PCR 扩增,并选用 BglⅠ和 EcoRⅡ两种限制性内切酶对扩增产物进行酶切分析。结果表明,草鱼和青鱼都可以扩增出1111 bp 的条带,两种酶切检验发现,草鱼扩增产物能被 BglⅠ切成247 bp 和864 bp 两个片段,而青鱼的 PCR 产物能被 EcoRⅡ切成140 bp 和971 bp 两个片段,这表明,mtDNA Cyt b 基因 BglⅠ和EcoRⅡ的酶切位点都可作为鉴定青鱼和草鱼的有效分子标记。利用 PCR -RFLP 分析 mtDNA Cyt b 基因的方法操作简单,是一种快速鉴别草鱼和青鱼的可靠方法。     

同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR的建立及应用

目的 建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法,并进行初步应用。方法 比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列,设计1对引物和探针,可同时检测MVM和MPV。考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度,并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为109～104拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强。应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测,结果为2份阳性样本,经MVM、MPV特异性探针鉴定,2份阳性样本均为MPV感染。阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对,一致率为96%。结论 建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法,能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒。     

科技新讯

草鱼出血病病毒的新发现草鱼出血病是淡水鱼养殖中危害极为严重的一种鱼病,被国家列为“六五”、“七五”期间攻关项目之一。杭州大学生物研究所和浙江淡水水产研究所合作对草鱼出血病的病毒学和细胞学研究表明,草鱼出血病是由两种病毒所引起的。     

运用RAPD技术检测Cu2+对草鱼基因组DNA的影响

对草鱼腹腔注射了CuSO4,抽取注射前后其血液以提取基因组DNA。选用10个随机引物对草鱼基因组DNA进行了RAPD扩增,结果表明:5个引物能产生1～5条扩增带,扩增产物分子大小在200～3500bp之间,其中引物S15和S16能检出用CuSO4染毒前后草鱼基因组DNA的差异。CuSO4可使草鱼基因组DNA发生改变,应对其使用加以限制。     

我国猕猴群中B病毒分离鉴定和检测方法研究初报

本实验从野外捕获的恒河猴的口腔溃疡灶中分离到一株病毒。该病毒在Vero细胞上具有B病毒特征性细胞病变 ,电镜观察具有疱疹病毒的典型形态与结构。经PCR扩增、SacⅡ酶切、PCR产物测序并与美国分离的BVE2 4 90株的部分基因序列进行比较 ,初步证实该分离株为B病毒 ,并命名为BV1 4 7株。用BV1 4 7株制备抗原片 ,并与国产HSV 1抗原片同时进行猴血清中B病毒抗体检测 ,可明显提高阳性检出率。B病毒的分离成功 ,对于提高我国实验猕猴的质量和检测水平 ,建立无B病毒猴群 ,增加出口创汇均具有十分重要的意义。     

SHBV的PCR检测方法的建立及其检测

以新分离的猴B病毒毒株为材料,建立了一种PCR快速鉴定SHBV的方法,并通过对PCR产物的限制性酶切分析可与HSV－1相区分,并对这一新分离的B病毒毒株的克隆片段进行了序列分析。     

LZF-Ⅰ探针及草鱼等三种鱼类的DNA指纹图的初步研究(英文)

研究鲤鱼,草鱼和鲢鱼等三种鱼类DNA指纹图的结果是;在大于4kb的谱带中,草鱼为15条,鲤鱼11条,鲢鱼仅3条.我们自己制备的LZF—I探针,能与鱼类基因组DNA中的简单重复序列杂交形成杂交分子.据分子杂交原理知,三种鱼类基因组DNA中存在同源DNA片段,同时,草鱼和鲤鱼间的亲缘关系较草鱼和鲢鱼间的关系近.     

光合细菌分离鉴定及其对草鱼鱼苗养殖水质的影响

从养殖池塘底泥样品中分离纯化得到紫色非硫光合细菌1株,通过观察分离菌株的细胞形态结构和16SrDNA序列分析,鉴定该株光合细菌属于沼泽红假单胞菌(Rhodops eudomonaspalusteris).采用三级扩大培养法生产光合细菌,活菌数达3×10~9 cfu/mL.在草鱼鱼苗养殖池塘投加光合细菌,可维持池塘透明度,明显降低亚硝酸盐和氨氮含量.     

呼肠孤病毒草鱼肾脏的病理变化观察

研究呼肠孤病毒草鱼肾脏感染后肾脏的病理变化.用常规(HE)染色方法观察草鱼在感染呼肠孤病毒后的病理改变,透射电镜观察感染呼肠孤病毒的草鱼肾脏的显微结构变化结果,临床上感染后的草鱼出现严重出血变化.7 d出现死亡并达到最高峰,死亡率为85%,H.E染色发现肾小管上皮和血管细胞严重变性、坏死,肾小球萎缩和基膜的间隙增大,部...     

仔猪腹泻病原的分离与鉴定

针对承德某猪场发生的仔猪腹泻,为了鉴定病原,无菌采集死亡仔猪的肺脏、肝脏、心血、淋巴结等病料组织,通过胶体金试纸条检测、PCR鉴定、细菌学鉴定、致病性试验等方法进行病毒及细菌鉴定。结果显示,圆环病毒2型检测为阳性,沙门菌对小白鼠具有很强的致病性。本例仔猪腹泻病原为圆环病毒2型和沙门菌混合感染。