利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPVl6E6蛋白

目的 利用昆虫一杆状病毒表达系统高效表达HPVl6E6蛋白.方法 将HPVl6E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTB),然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的 基因的杆状病毒转染昆虫(Sf-9)细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,westem-b10t分析鉴定表达蛋白.结果 SDS-PAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD,western-blot结果表明表达产物为HPV16E6蛋白.结论 利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达.     

利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPV16E6蛋白

目的利用昆虫-杆状病毒表达系统高效表达HPV16E6蛋白。方法将HPV16E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTb,然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的基因的杆状病毒转染昆虫（Sf-9）细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,Western-blot分析鉴定表达蛋白。结果SDS-PAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD,Western-blot结果表明表达产物为HPV16E6蛋白。结论利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达。     

neuritin基因杆状病毒表达载体的构建

为研究Neuritin蛋白的功能,将neuritinORF在杆状病毒-昆虫表达系统中表达,构建杆状病毒表达载体.以308D10为模板,利用PCR方法扩增neuritinORF,定向克隆法将其克隆至PFASTBAC-HTA转移载体中.然后利用同源重组原理将其转移至杆粒bacmid中.得到携带neuritin ORF的重组杆粒.本实验获得了重组目的基因真核表达载体并经PCR鉴定,插入片段方向、大小正确,DNA测序分析表明插入处接头和读框与预期序列相符,成功构建了Neuritin的杆状病毒表达载体.     

小鼠细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析

目的 利用杆状病毒表达系统合成重组小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白,并对其免疫原性分析。方法 将优化后的MVM VP2序列克隆至表达载体pFastBac1,命名为pFastBac1-MVM VP2,再将其转化至DH10Bac感受态大肠杆菌中形成重组杆粒,提取重组杆粒经PCR鉴定正确后转染昆虫细胞Sf9,镜下观察到细胞明显病变后收获重组杆状病毒rBac-MVM VP2。Sf9细胞接重组病毒48和72 h后,用间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)法验证重组蛋白的免疫原性。结果 构建的rBac-MVM VP2重组杆状病毒感染Sf9细胞后,可成功表达MVM VP2重组蛋白,经Western blot和IFA检测分析,重组蛋白具有较好的免疫原性且在病毒感染72 h时表达量较高。经蛋白纯化后可得到纯度较高的VP2重组蛋白。结论 本研究利用昆虫细胞-杆状病毒系统成功表达MVM VP2蛋白并具有良好的免疫原性,为VP2相关功能的研究和临床诊断方法的建立奠定基础。     

昆虫细胞杆状病毒表达人生长激素的纯化及性质研究

在昆虫细胞杆状病毒中表达的人生长激素，经CM－52离子交换柱层析和Phenyl-Sepharose CL-4B疏水柱层析后，去除了93％杂蛋白。再用CNBr-activated Sepharose 4B亲和柱层析的方法，获得高纯度的生长激素样品。SDS－PAGE结果表明，纯化样品在SDS－PAGE图谱呈现一条带，分子量为22kD。Western杂交结果表明，纯化样品与生长激素标准品有相似的免疫活性。胰肽图谱分析结果显示纯化样品和标准品具有相同的一级结构。DNS－CL测N末端表明，纯化样品的N末端为苯丙氨酸，所有这些性质均与天然人生长激素相同。     

杆状病毒及其应用

介绍了杆状病毒的基本概念,阐述了杆状病毒表达载体系统,回顾了杆状病毒生物杀虫剂的研究成果,展望了杆状病毒生物杀虫剂的应用前景。     

棉铃虫组织蛋白酶B在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

以棉铃虫（Helicoverpa armigera）组织蛋白酶B作外源基因重组构建克隆载体,自重组菌株HCB-DH10Bac、Histag-HCB-DH10Bac中提取穿梭质粒,脂质体法转染草地贪夜蛾卵巢细胞系Sf21细胞,转染液再感染细胞,收集感染3～4d的上清液,提取芽生病毒的DNA,PCR法鉴定外源HCB基因,感染上清进行SDS-PAGE、Western-blotting、蛋白酶活性检测．结果：感染上清中的芽生病毒的DNA作模板扩增出预期的1700bp片段,SDS-PAGE、westem-blotcing检测均在28ku处有明显表达产物,且表达产物有蛋白水解活性．     

人胰岛素基因重组杆状病毒在家蝇中表达的研究

目的利用杆状病毒表达系统进行人胰岛素基因在家蝇中表达的研究.方法用携带有人胰岛素基因的重组杆状病毒感染家蝇幼虫,用放射免疫技术、Tricine-SDS-PAGE和Western-blot技术对蝇蛆胰岛素表达水平进行检测.结果重组的杆状病毒感染家蝇幼虫后,蝇蛆中有人胰岛素的表达,表达量为37.401μIU/mL,占蝇蛆总蛋白的0.583%.结论利用杆状病毒表达系统可以在家蝇蝇蛆中表达人胰岛素.     

鸡染色质绝缘子HS4的不同区域对杆状病毒表达egfp基因的影响

染色质绝缘子是一种具有保护目的基因免受周围基因调控影响,保证基因稳定表达的DNA元件.前期的研究表明,当鸡染色质绝缘子HS4被置于目的基因表达框下游时,可以显著提高杆状病毒介导的基因的表达水平.为了进一步认识HS4作用的机制,构建了携带HS4绝缘子不同区域的6种重组病毒,比较了它们对报告基因egfp表达的影响.结果发现,相比对照病毒,插入HS4全长片段的重组病毒vBG-HS4-1200,以及同时插入250bp核心区域和400bp连接片段的重组病毒vBG-HS4-650在感染Sf9细胞后报告基因egfp的表达水平明显提高.这个结果与前人在哺乳细胞表达系统中所得出的结果基本相符,从而进一步证实HS4在裂解型病毒中同样可以通过表观遗传学修饰调控基因的表达.     

人甲胎蛋白增强子和鸡HS-4绝缘子对杆状病毒基因表达的影响

构建了2株重组杆状病毒AcGFP-E和AcGFP-E-I.两者均带有绿色荧光蛋白报告基因(gfp)的表达框和人甲胎蛋白增强子,同时后者还在报告基因表达框两侧带有鸡HS-4绝缘子.在昆虫细胞Sf9中,两种重组病毒都能正常复制.与仅带有报告基因的对照重组病毒AcGFP比较,AcGFP-E表达GFP的水平明显提高,但AcGFP-E-I表达水平却明显降低.这项研究首次分析了异源增强子和绝缘子对杆状病毒基因表达的影响,但其中的机制还有待深入研究.     

DNA甲基化对杆状病毒极早期和滞早期启动子转录活性的影响

利用体外DNA甲基化酶和荧光素酶报告系统分析了DNA甲基化对杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的8个极早期和滞早期基因启动子表达活性的影响.研究结果表明,病毒极早期基因ie1和ie0启动子的活性受到甲基化修饰的强烈抑制,pe38启动子活性受到部分抑制;同时滞早期启动子p35、DNApol、lef1、lef3和lef8的启动子则在甲基化处理后得到一定程度的激活.转染的同时用AcMNPV感染细胞,在多数启动子中并没有改变甲基化处理对它们表达活性的影响,但使其影响程度有所减弱.在另一些启动子(pe38,p35,lef1)中,AcMNPV的感染使甲基化的作用基本消失.这些结果表明DNA甲基化对一些杆状病毒启动子的转录活性有一定的调控作用.     

NDV核心抗原重组杆状病毒转移载体的构建

F和HN蛋白是新城疫病毒(NDV)中两种具有抗原性的表面糖蛋白．对NDV中国强毒株F48E8的F和HN基因进行了全长核苷酸序列分析．F基因的长度为1662bp，编码553个氨基酸，糖基化位点与已知的其他株系的位点相同；HN基因全长1904bp，编码571个氨基酸，其中第5个糖基化位点(第500～502个氨基酸)由NPT突变成NPV．为了便于在杆状病毒中表达，将F和HN基因的核心抗原区通过PCR扩增，并成功地克隆进杆状病毒转移栽体中，为利用杆状病毒表达系统生产抗新城疫病毒的基因工程疫苗打下基础．     

PRV闽A株gE基因抗原编码区片段在昆虫细胞中的表达研究

伪狂犬病病毒(PRV)糖蛋白E是一种在伪狂犬病的根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因抗原编码区片段克隆到杆状病毒Bac-to-Bac系统表达载体pFastBacHTa中,获得的重组表达载体pFastBacHTa-FS转化大肠杆菌DH10BAc感受态细胞后,得到的重组Bacmid DNA在脂质体介导下转染粉蚊夜蛾Hi5细胞,通过细胞内同源重组,获得了含目的片段的重组病毒.此重组病毒感染Hi5细胞后72 h,细胞总蛋白的SDS-PAGE与Western-Blot结果表明,gE基因抗原编码区片段在Hi5细胞中得到了正确表达,表达产物约35000,占细胞总蛋白的9.31%.溶解性分析显示该片段在Hi5细胞中为不可溶性表达.     

狂犬病毒核蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫原性的研究

目的在昆虫细胞中表达出狂犬病毒核蛋白(NP),并探讨重组NP的免疫原性.方法采用杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中表达狂犬病毒核蛋白,用直接免疫荧光(DFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测和分析,以感染重组杆状病毒的昆虫细胞裂解液免疫小鼠,检测表达产物的免疫原性.结果重组杆状病毒在昆虫细胞中获得表达,免疫小鼠可产生抗核蛋白抗体.结论在Sf9昆虫细胞中表达出狂犬病毒核蛋白,重组产物具有生物活性.     

温度对白斑综合症杆状病毒致病力的影响

当患有白斑综合症的病虾肉在水温55℃以上浸泡15min后，白斑综合症杆状病毒（WSBV）失活不能感染斑节对虾；患有白斑综合症的病虾肉在－20℃的冰箱保存60d后，WSBV仍然具有致病力；用患有白斑综合症的病虾肉投喂日本对虾和脊尾白虾时，养殖水温越低，死亡率也越低；病厚蟹肉在水温26－30℃的海水中浸泡81．5h后，WSBV不能感染斑节对虾。     

杆状病毒表达的hZP3 B细胞表位嵌合肽的免疫活性研究

为研究杆状病毒系统表达的人透明带ZP3的B细胞表位嵌合肽(BCP)的免疫原性及其抗血清与人透明带的免疫交叉反应，重组z3bcp病毒用于感染sf9细胞以表达BCP。Tricine—SDS—PAGE用于分离感染液中的小相对分子质量表达产物，表达产物用于免疫小鼠制备抗血清，免疫细胞化学试验用于检验抗血清与人卵泡透明带的交叉反应性。结果显示，矽细胞被z3bcp病毒感染后，培养液中分离出一条相对分子质量约为6000的特异带，而正常矽细胞中没有等同的带。免疫细胞化学试验结果显示，该特异肽的抗血清能与人透明带特异结合，表明人透明带BCP嵌合肽在杆状病毒系统中成功表达，表达产物具有抗原性，抗血清能与人透明带特异结合。