rcan1-1l基因的克隆和表达

从小鼠脑组织中通过总mRNA的提取、RT-PCR方法,利用pEASY-T1载体克隆出了鼠源rcan1-1l基因,并构建出了重组有rcan1-1l基因的PET21a原核表达质粒,进行了表达条件的初步摸索,这为今后研究rcan1-1l基因以及蛋白的结构与功能打下了前期实验基础.     

IL-2和EGFP共表达逆转录病毒载体的构建

设计质粒pR evT et-O n和pIRES2-EGFP的接头序列,经一系列酶切连接,重组为含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和多克隆位点(M CS)的逆转录病毒载体pR evIRES2-EGFP;同时将质粒pBV 220-IL-2和pEGFP-C 1重组为含有人白细胞介素-2(h IL-2)的过渡质粒pEGFP-C 1-IL-2.再酶切质粒pEGFP-C 1-IL-2,琼脂糖凝胶电泳回收IL-2基因片段,并将其连接到pR evIRES2-EGFP的多克隆位点中,转化E.coli DH 5α进行扩增,提取质粒DNA获得重组体pR evIRES2-EGFP-IL-2.鉴定结果表明构建的逆转录病毒表达载体pR evIRES2-EGFP-IL-2完全正确.     

人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人NOD8基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体.方法:用特定的限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因启动子不同长度2段序列,并进行酶切以切除启动子的pEGFP-C2作框架结构,插入表达载体pEGFP-C2中,构建含有人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp),用Vsp Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析.构建的重组质粒经脂质体(lipofectamine)TM2000介导转染HEK293、K562和HeLa细胞,转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察.结果:pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的2段重组质粒转染HEK293、K562及HeLa细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-NOD8(760 bp)重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-NOD8(520 bp).结论:成功构建2段不同长度的人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体.     

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.     

Pdx1与Ngn3协同诱导LO2细胞分化为胰腺β样细胞

目的:胰腺十二指肠同源框蛋白1(Pdx1)与神经源素3(Ngn3)联合诱导肝实质细胞向胰腺β样细胞分化.方法:以人胚胎胰腺组织基因组的mRNA为模板经RT-PCR扩增获得Pdx1与Ngn3基因.应用分子生物学技术,分别克隆到真核表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建pEGFP-C1/Pdx1与pEGFP-C1/Ngn3真核表达质粒,并共转染LO2细胞,用RT-PCR、免疫组化、间接荧光法检测目的基因及胰岛素相关基因葡萄糖转运体2(GLUT2)与胰岛素的表达情况.结果:目的基因克隆正确,RT-PCR、免疫组化、间接荧光证实转染后LO2细胞中有Pdx1、Ngn3和胰岛素及胰岛素相关基因GLUT2的表达.结论:Pdx1与Ngn3协同作用可诱导肝实质细胞向胰腺β样细胞分化.     

人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人RIP2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:根据特定限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含人RIP2基因启动子不同长度2段序列,构建含人RIP2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt、pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt,用VspⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒,进行DNA序列分析,重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导转染HEK293细胞48 h后观察。结果:酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,重组质粒转染HEK293细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt。结论:成功构建2段不同长度的人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。     

陕西洛川L_1-S_8黄土和古土壤水分特征研究

分析陕西洛川L1-S8黄土和古土壤层水分特征,为研究黄土高原土壤水分运动及农业发展、生态建设提供依据。采用张力计法、环刀法等对洛川L1-S8黄土和古土壤层共16层32个原状土样进行水分特征曲线、田间持水量等的实验测定。用Van Genuchten模型对洛川L1-1-S8-2黄土和古土壤的水分特征曲线进行拟合,R2值达0.98以上,每个黄土层及其相邻下部的古土壤层的水分特征曲线相互交叉。洛川黄土层的土壤水分特征用Van Genuchten模型描述最适合;L1-L8黄土层的持水性在低吸力段强于相邻下部的S1-S8古土壤层,在较高吸力段弱于相邻下部的S1-S8古土壤层;总体上看洛川L1-S8黄土层的饱和含水量都比相邻下部的古土壤层高,稳定凋萎系数略低,最大有效水含量略高;L1-S5中黄土层的田间持水量比相邻下部的古土壤层高,L6-S8中黄土层的田间持水量比相邻下部的古土壤层略低。     

木犀草素抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化

为研究木犀草素在3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中的作用,文章探讨木犀草素抑制脂质沉积的作用机制,选取3T3-L1前脂肪细胞作为研究对象,在其分化过程中添加木犀草素,利用噻唑蓝(MTT)实验研究木犀草素对3T3-L1增殖的作用;利用油红O染色确定其对3T3-L1前脂肪细胞脂肪化的影响;利用定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测木犀草素对3T3-L1脂肪化相关基因的表达影响。结果表明,20μmol/L的木犀草素可以降低3T3-L1细胞的脂肪化,减少脂质聚集,并且降低了3T3-L1细胞中脂肪化相关基因Pparγ、C/EBPα、Ap2和Fas等基因的表达。     

pEGFP-Egr-1表达质粒构建及其表达抑制HepG2细胞增殖

将RT-PCR扩增的Egr-1基因连接到pMD-18载体上并测序鉴定,经测序正确的Egr-1基因亚克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1上构建成重组质粒pEGFP-Egr-1.重组质粒pEGFP-Egr-1转染HepG2细胞后,运用荧光显微镜及荧光定量PCR技术分析其在HepG2细胞中的表达情况,并进一步运用WST-1法分析其表达对HepG2细胞增殖的影响.结果显示,重组质粒pEGFP-Egr-1构建正确,转染后在荧光显微镜下观察可见HepG2细胞发出绿色荧光信号,荧光定量PCR分析发现转染后HepG2细胞Egr-1基因mRNA水平明显升高.WST-1结果表明,与对照组相比,转染pEGFP-Egr-1质粒的HepG2细胞,其增殖速率明显下降.上述结果表明,pEGFP-Egr-1重组质粒构建成功,外来过表达Egr-1基因能够抑制HepG2细胞增殖.     

烟草eIF4E-1-L的基因组编辑

通过CRISPR/Cas9系统对烟草中的目的基因eIF4E-1-L进行基因敲除.实验通过遗传转化、PCR检测和测序后得到3个突变样本,所有的突变样本与原始序列相比均发生了移码突变,丧失了功能,为烟草中eIF4E-1-L基因的功能分析提供了基础材料.     

水动力转染技术建造慢性乙型肝炎动物模型特效研究

摘要: 目的比较不同质粒建立的水动力转染乙型肝炎小鼠模型的特性。方法将pcDNA 3. 1-1. 3-HBV-C 与PAAV-1. 2-HBV-A 两种质粒通过水动力转染法建立两种乙型肝炎小鼠模型,通过对建模成功率和小鼠外周血HBsAg 滴度及稳定性,T 细胞指数流式等检测分析,比较不同模型差异和特效。结果转染pcDNA3. 1-1. 3-HBV-C质粒建模成功率为78. 6%,转染后体内HBsAg 滴度最高达到220IU/mL; 转染PAAV-1. 2-HBV-A 质粒建模成功率为56%,转染后体内HBsAg 滴度最高达到2 300IU/mL。建模小鼠的肝脏进行切片,做免疫组化后,观察实验结果,转染pcDNA 3. 1-1. 3-HBV-C 质粒的小鼠肝脏切片的HBsAg 免疫组化较PAAV-1. 2-HBV-A 质粒小鼠颜色面积更大。实验小鼠转染质粒后6 周的外周血进行流式细胞术检测,结果显示特异性T 细胞CD4 +、CD8 + 和正常小鼠比较,两种质粒的造模小鼠未有差别。结论利用水动力转染法用不同质粒建造乙型肝炎小鼠模型在乙肝病毒指标水平和稳定性方面有着显著差异。     

纳米固体超酸SO_4~(2-)/ZrO_2-SiO_2催化剂的研究

采用改性技术合成了新型的纳米固体超酸催化剂SO42-/Z rO2-S iO2,对醋酸和脂肪醇的酯化反应有很好的催化作用.该催化剂具有耐水性强,稳定性好,再生容易,可重复使用,不腐蚀设备,不污染环境,是对环境友好的很有应用前景的绿色工业催化剂.用XRD、XPS、TEM、IR和化学分析等手段分析了SO42-/Z rO2-S iO2的晶化过程,比表面积含硫量.结果表明浸渍液H2SO4浓度、陈化温度、焙烧温度、沉淀条件,比表面积和含硫量均明显影响SO42-/Z rO2-S iO2的酸强度及催化活性.SO42-/Z rO2-S iO2最佳制备条件:陈化温度-15℃,浸渍液H2SO4浓度为0.5 m o l/L,焙烧温度为650℃,焙烧时间为3 h.     

基于半刚性对映配体的螺旋单一手性配位聚合物

在辅助配体3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-1-基)吡啶(MIMIP)的辅助下, 乳酸衍生物(R)-4-(1-羧基乙氧基)苯甲酸((R)-H₂CBA)和(S)-4-(1-羧基乙氧基)苯甲酸((S)-H₂CBA)分别与Cd(Ⅱ)通过溶剂热反应得到一对结构新颖的单一手性配位聚合物-[Cd((R)-CBA)(MIMIP)\]·H₂O (1-R)和[Cd((S)-CBA)(MIMIP)]·H₂O (1-S), 并测试两个配合物的粉末衍射光谱、 热稳定性、 紫外-可见吸收光谱和荧光性质.  结果表明： 1-R和1-S均结晶于单斜的P2₁2₁2₁空间群, 具有三维超分子框架的对映体; 在1-R中, (R)-CBA^2-和MIMIP分别与Cd(Ⅱ)沿b轴形成两种右手螺旋链, 在1-S中, (S)-CBA^2-和MIMIP与Cd(Ⅱ)形成对映的左手螺旋链;  (R)-CBA^2-和MIMIP与Cd(Ⅱ)在1-R中形成左手螺旋链,(R)-CBA^2-和MIMIP与Cd(Ⅱ)在1-S中形成对映的右手螺旋链.     

pEGFP-IFI16表达载体构建及其表达对Hep-2细胞增殖的影响

RT-PCR扩增的IFI16基因连接到pUCm-T载体并测序鉴定,经测序正确的IFI16基因再连接到pEGFP-C1载体构建pEGFP-IFI16重组质粒,重组质粒pEGFP-IFI16转染Hep-2细胞后用荧光显微镜及半定量RT-PCR分析其表达情况,并用流式细胞仪测定细胞生长曲线分析其表达对Hep-2细胞增殖的影响.结果显示pEGFP-IFI16重组质粒构建正确,转染Hep-2细胞后荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,半定量RT-PCR结果显示转染后Hep-2细胞IFI16基因条带亮度明显升高,细胞生长曲线测定结果显示转染后Hep-2细胞从第二天起其增殖速度变慢、至第三天时其增殖速度明显慢于对照细胞的增殖速度.说明成功构建了能在Hep-2细胞中表达EGFP-IFI16融合蛋白的pEGFP-IFI16重组质粒,pEGFP-IFI16重组质粒体表达能抑制Hep-2细胞的增殖.     

木犀草素对3T3-L1细胞成脂分化不同阶段的影响

为了研究木犀草素对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中各个阶段的作用,文章探讨相关的分子机制,在细胞分化的不同阶段添加20μmol/L木犀草素处理,通过油红O染色和定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测其对3T3-L1前脂肪细胞脂肪化过程的细节作用。3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程共需8 d,结果表明,木犀草素从细胞分化开始处理8 d可以显著降低其脂滴生成及脂肪化相关基因PPARγ、C/EBPα、Ap2和Fas等的表达,处理2、4、6 d对脂滴生成抑制效果不明显,但可以显著抑制脂肪化相关因子表达,说明木犀草素在3T3-L1细胞的前期分化和后期成熟过程都发挥了重要作用。     

维生素C调控成脂相关分子表达促进成脂

探讨维生素C影响3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中成脂相关分子胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)和脂联素(adiponectin)表达水平的时序性变化特征。结果表明:维生素C处理组的成脂率明显大于非处理组的;维生素C处理组SREBP-1、PPARγ2和C/EBPα的转录水平在3T3-L1细胞整个分化过程中明显大于非处理组的,脂联素的转录和翻译水平均显著小于非处理组的;维生素C处理组SREBP-1、PPARγ2和C/EBPα的翻译水平在早、中期明显大于非处理组的,晚期时与非处理组基本一致;维生素C在3T3-L1细胞成脂分化早、中期上调SREBP-1、PPARγ2和C/EBPα的表达,而在整个分化过程中下调脂联素的表达,促进3T3-L1细胞的成脂分化进程。     

砷对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响

通过砷(Arsenic)干预3T3-L1前脂肪细胞观察其对该细胞增殖和分化的影响。用药物对3T3-L1前脂肪细胞进行诱导分化,采用油红O染色方法对脂肪细胞进行鉴定;然后用MTT和细胞计数器检测正常组和砷染毒组3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响,并筛选合适砷浓度;正常组和砷染毒组3T3-L1前脂肪细胞,诱导分化为脂肪细胞,提取油红O染液,通过比色定量分析检测两组3T3-L1前脂肪细胞分化过程中胞浆脂质的堆积,检测砷对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。结果显示:低浓度砷(5μmol/L以下)对3T3-L1前脂肪细胞的生长表现为促进趋势,相反,高于此浓度时抑制其细胞的增殖;不同浓度砷对3T3-L1前脂肪细胞分化表现为抑制趋势并呈一定的量效关系,和对照组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。由此得出以下结论:低浓度砷(5μmol/L以下)可以促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖,高浓度砷抑制其增殖;不同浓度砷对3T3-L1前脂肪细胞的分化都产生抑制作用。     

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒ORF50结合蛋白的筛选

应用酵母双杂交系统,以包含RTA氮端530个氨基酸的片段插入载体pGBKT7作为诱铒,在人脾脏cDNA文库中,筛选得到4个阳性AD/文库质粒,并用酵母双杂交实验验证了阳性AD/文库质粒与RTA的相互作用.将阳性AD/文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析,发现它们分别是:TLE2、RBP-Jk、ZNF-12和WHSC1.     

广东分离株HPV16型L2与重组E7融合蛋白原核表达载体的构建

分析广东分离株HPV16型的L2和E7基因结构,并对E7的4个功能区重新排列组合形成失去致癌作用但其抗原表位不改变,其命名为rE7,构建pET-28a-L2、pET-28a-rE7、pET-28a-L2-rE7、pET-28a-rE7-L2 4个原核表达质粒.采用PCR技术从广东分离株HPV16基因组中扩增L2基因;用重叠PCR技术人工合成rE7基因和L2-rE7、rE7-L2融合基因,并构建到原核表达载体pET-28a(+)上. 成功扩增广东分离株HPV16型 L2基因,经重叠PCR技术成功得到rE7、L2-rE7和rE7-L2基因并成功构建了原核表达的4个载体:pET-28a-L2、pET-28a-rE7、pET-28a-L2-rE7、pET-28a-rE7-L2. 广东分离株HPV16型L2基因与中国标准株有9处不同,同源性为99.37%,其编码氨基酸序列有8处突变. 成功合成失去致癌作用的基因rE7及构建4个原核表达载体.