一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达

将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.     

转座元件介导的苯胺代谢基因簇的筛选和鉴定

利用苯胺不完全降解时中间代谢产物, 如邻苯二酚等的显色反应, 建立了简便快速的苯胺代谢途径相关基因的功能筛选方法. 从苯胺降解菌株AD9的基因组文库中筛选得到3个阳性重组子pDA1, pDB2和pDB11. AD和C23O酶活测定结果表明, pDA1和pDB11分别含有功能完整的苯胺双加氧酶或邻苯二酚双加氧酶编码基因. 经核苷酸序列分析和拼接获得一个大小为24.7 kb, 含25个可读框的苯胺代谢基因簇, 其中含有17个基因与苯胺代谢有关, 包括调控基因tadR, 苯胺双加氧酶基因簇tadQTA1A2B, 邻苯二酚间位裂解途径酶系基因簇tadD1C1D2C2EFGIJKL. 苯胺代谢基因簇两侧含有转座酶和IS1071序列.     

一株分离自新疆天池寡营养环境的糖丝菌(Saccharothrix sp PYX-6)降解芘的特性

从没有被芳烃污染的新疆天池采集的水样中分离得到一株能够以蒽、菲、芘为惟一碳源和能源的菌株, 并编号为PYX-6.通过对其形态、生理生化特征、细胞壁组分、脂肪酸组成、DNA分子(G + C)摩尔百分含量及16S rDNA 序列同源性比较发现, 菌株PYX-6为Saccharothrix sp.对菌株PYX-6以芘为惟一碳源生长和底物降解的研究结果表明, 0.005%酵母膏对细胞生长和芘降解具有明显的促进作用, 细胞生长和底物降解的最佳pH和摇床转速分别为pH 6～8和200 r/min, 细胞生长比底物消失稍迟.对降解过程中间代谢产物进行质谱分析表明, 邻苯二甲酸是芘降解的中间代谢产物, 说明Saccharothrix sp PYX-6 的降解途径不同于过去报道的Mycobacterium sp PYR-1 的降解途径.     

节杆菌PJ3基因组中发现2,3-二羟基联苯双加氧酶基因

从污水中分离出一株以咔唑为惟一碳源和氮源生长的菌株PJ3, 用 16S rDNA 鉴定为节杆菌(Arthrobacter sp), 构建了PJ3菌株基因组文库并获得一株阳性克隆JM109 (pUCW402). 通过GenSCAN软件和BLAST分析发现, 在插入pUCW402的外源片段(3360 bp)中存在一个由933 bp片段编码的2,3-二羟基联苯双加氧酶基因. 进化分析表明, 从PJ3来源的2,3-二羟基联苯双加氧酶在进化树上形成一个独立的分支. Southern杂交进一步证实, 编码该酶的基因定位于节杆菌PJ3的基因组DNA上. 为了鉴定该基因的生物学功能, 构建了BL21 (pETW-8)重组菌株. 与菌株JM109 (pUCW402)和PJ3相比, 2,3-二羟基联苯双加氧酶的表达水平在BL21 (pETW-8)中最高. 酶活分析表明, 2,3-二羟基联苯双加氧酶不具有绝对专一性, 对2,3-二羟基联苯的催化能力高于邻苯二酚. 因此推测PJ3菌株对芳香族化合物降解过程中, 2,3-二羟基联苯双加氧酶主要负责催化双环化合物的降解.     

合成生物学策略发现新型核糖体肽Xenopeptide

S-腺苷甲硫氨酸自由基(rSAM)酶家族是目前已知的最大酶超家族之一,由22000多个成员组成.这些酶在大自然中广泛存在,被认为是地球上最早的生物催化剂之一.随着大量的微生物基因组信息被解析,分析显示,微生物中大量核糖体肽类天然产物的生物合成基因簇中含有rSAM酶;其中Xenorhabdus、Yersinia和Erwinia三个属的基因组中均含有一个高度保守的rSAM酶负责其相邻核糖体肽的前体修饰,此类前体肽和rSAM酶构成的XYE系统所合成的化合物鲜有报道.本研究合成一个来源于Xenorhabdus sp. KJ12.1的XYE系统的前体肽和rSAM修饰酶基因,在大肠杆菌中进行共表达,得到新型核糖体肽Xenopeptide,通过结构解析发现, rSAM酶XenB负责分子内2个碳碳键的形成.本研究为微生物中此类化合物的深度挖掘和合成生物学改造提供了理论支撑.     

家蚕(苏·菊×明·虎)幼虫血清蛋白基因(BmLSP)启动子特性分析

从家蚕品种苏·菊×明·虎基因组DNA中克隆了家蚕幼虫血清蛋白基因(1arval serum protein,Bombyx mori,BmLSP)的调控序列,涵盖了第1内含子、第1外显子、启动子区和上游区.通过PCR技术与限制性内切酶酶切方法,以荧光素酶(luc)为报告基因,构建了一系列缺失不同调控元件的报告质粒,在家蚕BmN细胞瞬时表达系统中进行了BmLSP启动子的特性分析.结果表明,含第1内含子和家蚕丝素轻链基因同源区序列的BmLSP启动子活性分别比缺失相应序列的启动子活性提高5.8和4.4倍,暗示该两段调控序列中含有增强启动子活性的调控元件.上游区失活的部分水手转座子元件对BmLSP启动子活性有一定的抑制作用.此外,外源昆虫保幼激素类似物(JHA)呈现剂量依赖效应,低浓度处理增强启动子活性,高浓度处理起抑制作用;而蜕皮激素(MH)对其活性没有显著影响.     

在大肠杆菌和沙门氏菌中整合位点为tmRNA 的串联基因岛的模式和整合的时序性

tmRNA 是部分tRNA 和一小段mRNA 的结合体, 已被证明是作为基因水平转移产物之一的基因岛的整合位点. 我们通过序列比对和比较基因组学的方法确定了散布在肠杆菌科的13 个属中整合位点为tmRNA的68 个基因岛, 其中53 个基因岛属于大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella enterica). 在这53 个基因岛中, S. enterica subsp. enterica serovar Agona str. SL483 等8 个基因组, E. coli S88 和E. coli O55:H7 str. CB9615 中发现了2 个及以上连续的基因岛, 即形成了串联基因岛. 其中, S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium SL1344 中发现在该位点有3 个连续的基因岛组成的串联基因岛. 通过在大肠杆菌和沙门氏菌已测序的基因组中分析整合位点为tmRNA 的可变区, 发现大多数的基因组除了在可变区中包括了基因岛区之外, 还有一段残余的可变区. 确定了串联基因岛进入基因组的时间顺序, 即远离tmRNA 的基因岛先于靠近tmRNA 的基因岛整合进入该基因组中. 上述的基因岛中整合酶主要有3 种类型, 分别是HP1 整合酶, PhiCTX 整合酶和P4 整合酶, 以P4 整合酶所占的比例最多. 在串联基因岛中, 远离tmRNA 的基因岛中的整合酶是P4 整合酶, 其次是PhiCTX 整合酶,最靠近tmRNA 的基因岛所用的整合酶是HP1 整合酶, 由此可以得出tmRNA 是研究串联基因岛的遗传与进化的重要位点的结论.     

基于玛氏骨条藻(Skeletonema marinoi)转录组的碳固定代谢途径分析

以玛氏骨条藻(Skeletonema marinoi)转录组信息为基础,分析了其碳固定代谢途径,共发现18种酶对应的34个编码基因,构建了玛氏骨条藻进行碳固定代谢途径的通路图.这些编码基因的序列比对结果表明,其与假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)的同源基因具有较高的一致性.对这些样品进行数字基因表达谱的差异基因分析,获得了不同生长时期碳固定代谢途径酶编码基因的差异表达情况.通过分析发现,C3和C4代谢途径中存在表达差异的基因分别有7和3个,其中果糖-1,6-二磷酸酶和丙酮酸磷酸双激酶的编码基因表达在指数生长期之后出现显著上调.这有助于对玛氏骨条藻碳固定代谢途径中关键编码基因调控过程的解析,为进一步研究硅藻的固碳机制奠定了基础,也为深入了解碳的生物地球化循环提供了新的研究方向.     

贮藏温度对鲜枸杞类胡萝卜素和氨基酸的影响及调控机制

本研究探讨了4和-4℃贮藏对鲜枸杞类胡萝卜素水平、类胡萝卜素合成、存储、降解相关基因以及氨基酸代谢相关基因表达的调控作用.结果表明,–4℃贮藏的枸杞果实中β-胡萝卜素、玉米黄素和玉米黄素双棕榈酸酯含量显著高于4℃,贮藏末期玉米黄素双棕榈酸酯含量比4℃贮藏高42.14%.枸杞果实低温贮藏过程中类胡萝卜素合成、存储和降解相关基因普遍上调表达,特别是类胡萝卜素裂解酶基因LbCCD4在贮藏过程中表达量升高超过70倍. 4℃贮藏枸杞果实类胡萝卜素合成基因表达显著高于–4℃,但是存储蛋白基因LbHSP21、LbOR2表达极显著低于–4℃,降解酶基因LbNCED6、LbCCD1、LbCCD4则极显著高于–4℃,可能是导致其类胡萝卜素含量低于–4℃的主要原因.另一方面, 4℃贮藏上调脯氨酸合成相关的LbOAT表达、维持脯氨酸降解相关的LbProDH在较低水平,从而有利于脯氨酸的积累.上述结果说明,–4℃贮藏更有利于枸杞类胡萝卜素的积累、保持较好的营养品质,并延缓果实衰老劣变.     

代谢型谷氨酸受体mGluR7的基因组结构及其家族蛋白胞外区的基因组结构比较

L-谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中的神经递质, 其代谢型谷氨酸受体mGluR7在正常中枢神经功能和多种神经退行性疾病的病理发生中起着重要作用. 为了研究mGluR7基因相关疾病的生物和遗传基础, 通过从BAC文库中筛选种子克隆和对酶切指纹图谱数据库查询等方法, 构建了覆盖mGluR7全长基因的基因组物理图谱, 并采用鸟枪法策略对图中BAC克隆进行测序与拼接组装, 最终得到准确度为万分之一的完整的基因组序列. 序列分析表明: mGluR7基因是长达880 kb的超大基因; 其基因组GC含量为38%, 重复序列含量为37.5%; 由11个外显子和10个内含子组成, 其中5个内含子长度超过100 kb, 内含子1长达285 kb; 存在2个替换剪接转录本mGluR7a和mGluR7b. 通过比较mGluR基因家族3组8个亚型受体蛋白胞外区的基因组结构, 发现它们对应的基因组结构分为3组, 组内各成员的基因组结构较为保守, 而组间各成员的基因组结构保守性较差. 这种基因组水平的组内保守和组间差异是和蛋白质水平上的保守和差异一致的, 提示这些受体的基本功能在进化的过程中有明显的分化. 在含mGluR7的组内, 尽管组内各成员的基因组结构趋于保守, 但大部分内含子长度变化幅度很大, 揭示基因组结构变化的程度高于蛋白质水平的变化, 这种变化预期是在基因表达的调控上体现其生物属性的.     

一株分离自新疆天池寡营养环境的糖丝菌(Saccharothrix sp PYX-6)降解芘的特性

从没有被芳烃污染的新疆天池采集的水样中分离得到一株能够以蒽、菲、芘为惟一碳源和能源的菌株, 并编号为PYX-6. 通过对其形态、生理生化特征、细胞壁组分、脂肪酸组成、DNA分子(G + C)摩尔百分含量及16S rDNA 序列同源性比较发现, 菌株PYX-6为Saccharothrix sp. 对菌株PYX-6以芘为惟一碳源生长和底物降解的研究结果表明, 0.005%酵母膏对细胞生长和芘降解具有明显的促进作用, 细胞生长和底物降解的最佳pH和摇床转速分别为pH 6~8和200 r/min, 细胞生长比底物消失稍迟. 对降解过程中间代谢产物进行质谱分析表明, 邻苯二甲酸是芘降解的中间代谢产物, 说明Saccharothrix sp PYX-6 的降解途径不同于过去报道的Mycobacterium sp PYR-1 的降解途径.     

斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501氧胁迫下基因表达谱研究

斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501分离自我国南方水稻田, 在低铵和微好氧条件下能紧密结合在水稻根表, 并侵入根内生长和固氮. 为探讨氧对A1501基因组表达的影响, 利用全基因组芯片技术, 研究不同氧浓度(0.5%, 21%)下A1501基因组表达谱, 结果表明: (ⅰ) 67个基因在高氧浓度下表达上调2倍以上, 其中17个基因的功能未知; (ⅱ) 68个基因在高氧条件下表达, 其中约50%的基因参与固氮或反硝化. 实时定量RT-PCR验证结果表明, 4个编码氧化还原酶的基因和7个编码胞外夹膜多糖和抗原寡糖合成的基因在高氧下表达上调, 其中sodC在高氧下表达上调2.7倍、编码黄素单胺氧化酶相关蛋白的基因PST1610表达上调2.2倍、编码α-酮戊二酸-铁氧化酶族氧化还原酶的基因PST3584表达上调3.2倍、编码NAD依赖型氧化还原酶的基因PST2179表达上调2.9倍. 这些基因及其表达产物可能在A1501氧保护机制中发挥作用.     

降解非离子表面活性剂--嗜冷菌的筛选及其降解性能

从洗涤剂生产车间曝气池活性污泥中分离出1株降解AEO型非离子表面活性剂C_(12)E_7的高效嗜冷菌株,该菌株在5℃的低温下48h内对20 mg·L~(-1)C_(12)E_7,的降解率可达70％以上;弱碱性、低浓度底物的初始环境有利于菌株生长及底物降解;低温条件(5～10℃)同样获得较高降解率;对氮源无特殊要求;细菌利用添加的低浓度葡萄糖(0.1％)与C_(12)E_7进行共代谢,可增强降解效果,本菌株将会在特殊条件下的废水处理中得到应用。     

Bt杀虫基因在转基因双价抗虫棉中的整合与遗传稳定性

Bt抗虫棉中Bt杀虫基因的表达与遗传稳定性对抗虫棉的品种培育和商品化生产至关重要,利用转基因双价抗虫棉R3,R4及R5材料基因组DNA,然后采用GFMCryIA基因的PstI酶切片段做探针,进行Southern杂交分析,研究Bt杀虫基因在双抗抗虫棉虫棉所19材料基因中的整合、拷贝数及遗传稳定性,结果表明,转基因抗虫棉和阳性对照经HindⅢ酶切,Southernblot均出现了约4．7kb的杀虫基因阳性带,从而在分子水平上证实了杀虫基因在棉花基因组中的整合及其完整性,利用在杀早基因中只有一个酶切位点的XhoI酶切后,阳性对照出现了预期大小的17．7kb的阳性带,而双价转基因抗虫棉R3,R4及R5材料均出现了分别为约17．7,8．0,5．5和4．7kb的4条阳性带,初步认为,外源Bt杀虫基因在双价抗虫棉中棉所19材料基因组中至少有4个拷贝,这4个拷贝中很可能有一个以上能够稳定遗传和表达,该研究结果为以后的双价抗虫棉品种培育及商品化生产提供了依据。     

家蚕(苏·菊×明·虎)幼虫血清蛋白基因(BmLSP)启动子特性分析

从家蚕品种苏·菊×明·虎基因组DNA中克隆了家蚕幼虫血清蛋白基因(larval serum protein, Bombyx mori, BmLSP)的调控序列, 涵盖了第1内含子、第1外显子、启动子区和上游区. 通过PCR技术与限制性内切酶酶切方法, 以荧光素酶(luc)为报告基因, 构建了一系列缺失不同调控元件的报告质粒, 在家蚕BmN细胞瞬时表达系统中进行了BmLSP启动子的特性分析. 结果表明, 含第1内含子和家蚕丝素轻链基因同源区序列的BmLSP启动子活性分别比缺失相应序列的启动子活性提高5.8和4.4倍, 暗示该两段调控序列中含有增强启动子活性的调控元件. 上游区失活的部分水手转座子元件对BmLSP启动子活性有一定的抑制作用. 此外, 外源昆虫保幼激素类似物(JHA)呈现剂量依赖效应, 低浓度处理增强启动子活性, 高浓度处理起抑制作用; 而蜕皮激素(MH)对其活性没有显著影响.     

一种新的有机磷降解酶的分离纯化及酶学性质研究

从农药厂被污染的土壤中分离到一株降解有机磷农药的高效菌株C2-1, 经鉴定表明为假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes). 对其产生的有机磷降解酶OPHC2进行了分离和纯化, 并对其酶学性质进行了研究. 其降解甲基对硫磷的最适温度为65℃, 最适pH为9, 并且此酶具有很好的热稳定性和pH稳定性, 对大多数金属离子和化学试剂不敏感. OPHC2氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列分析表明, OPHC2与目前发表的有机磷降解酶没有同源性.     

phbB基因在莱茵衣藻中的表达与分子检测

通过构建依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶基因(phbB)的衣藻表达载体, 用石英砂VOTEX转化技术, 将phbB基因导入细胞壁缺陷的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii cc-849)中, 用含有10 μg/mL的Zeomycin的平板培养基进行筛选和实验室保持培养, 得到了表达phbB基因的转基因藻株. PCR和Southern blot结果显示phbB基因已整合到莱茵衣藻基因组中. RT-PCR与DNA杂交的检测结果显示, 导入的phbB基因在衣藻中具有转录活性.     

乳胶清除蛋白LcpK30催化氧气裂解聚顺-1,4异戊二烯机理

乳胶清除蛋白LcpK30是一种内型双加氧酶,其通过活化分子氧催化裂解化学惰性的聚顺-1,4异戊二烯,进而生成醛和酮.实验发现活性区域的谷氨酸148对活性有重大影响,然而其作用机制和整个反应机理仍然存在争议.本研究使用量子力学/分子力学组合方法研究了乳胶清除蛋白催化分子氧氧化裂解天然橡胶模型化合物的反应机理.计算结果显示谷氨酸148在反应过程中为质子化态,并与铁(Ⅲ)-超氧物种形成稳定氢键,因此其作用可能与调节铁(Ⅲ)-超氧物种与底物的位置有关.可能反应机理为:(1)铁(Ⅲ)-超氧物种的远端氧进攻底物碳碳双键,形成过氧烃自由基中间体;(2)近端氧回弹到碳自由基,形成过氧化物中间体和铁(Ⅱ)中心;(3)铁(Ⅱ)调节的过氧化物中间体O–O键还原裂解,生成邻二醇自由基负离子中间体;(4)邻二醇自由基负离子C–C键断裂,生成产物醛和酮.此外,计算发现,过氧化物中间体O–O键直接断裂反应能垒超过160 kJ/mol,表明铁(Ⅱ)的催化对于过氧化物中间体的后续转化至关重要.因此,本研究结果不仅加深对于Lcp_(K30)反应机理的理解,而且为Lcp酶降解合成橡胶材料的设计和工程化提供有用信息.     

藻类特有的捕光色素蛋白——藻红蛋白的结构、功能及应用

藻胆蛋白(phycobiliprotein, PBP)是红藻、蓝藻和部分隐藻中特有的捕光色素蛋白.自PBP被发现以来,科学家们对其结构、功能及应用进行了深入的研究.藻红蛋白(phycoerythrin, PE)是PBP的一种,由α,β和γ三种亚基组成.其中γ亚基具有连接和稳定的作用,使PE能够以稳定的(αβ)6γ的形式存在. PE可以共价连接藻红胆素和藻尿胆素等色基,对短波长的蓝、绿光具有较强的吸收效率,使红藻和蓝藻能够在深水弱蓝、绿光环境中高效地捕获和传递光能.高纯度的PE与生物素、单克隆抗体等蛋白结合稳定,可以作为荧光免疫等技术中的荧光探针;同时, PE具有抗氧化及抗炎活性,对阿尔茨海默病、肝肾毒、糖尿病等疾病具有一定缓解作用.本文主要对PE的结构、制备及光学活性和生物活性方面的应用进行了综述,并对PE的应用进行了展望,为我国海洋藻类的高值化加工和应用提供参考.     

水稻白穗突变体基因的鉴定和染色体定位

从一个水稻籼粳交F₆后代自然群体中获得1例白穗突变体, 其成熟植株基部少数叶片中脉呈现白色, 抽穗后穗粒内外稃和枝梗均表现白色. 用突变体作母本与一粳稻恢复系品种制7杂交, 获得一个F₂分离群体. 初步的遗传分析表明, 该突变属单基因隐性性状. 利用已定位的微卫星标记进行连锁分析, 发现该基因位于水稻第1染色体上. 进一步根据已完成的水稻基因组序列寻找微卫星位点, 连锁分析显示, 该基因位于微卫星标记SSR101和SSR63.9之间, 分别相距2.3和0.8 cM; 并与微卫星标记SSR17呈共分离. 该基因暂定名为wp(t).