SARS相关病毒(BJ01株)的全序列及其比较分析

严重急性呼吸综合征(SARS)是一种新发现的急性传染病. 对一株已确认为SARS病原体的冠状病毒(BJ01)进行了全基因组序列测定, 并与其他已知病毒进行了比较分析. 该病毒基因组全长为29.725 kb, 含11个可读框(ORFs), 由1个稳定区和1个可变区组成, 其中稳定区编码RNA依赖性RNA聚合酶, 包括两个ORFs；可变区含有4个蛋白质编码序列(CDSs), 分别编码病毒的4个结构蛋白(S, E, M, N蛋白). 此外, 可变区还包括5个非典型的预测蛋白(PUPs). 此病毒基因的排列顺序与其他已知的冠状病毒一致. 通过与已知RNA病毒的序列比对, 可以确认该病毒属于冠状病毒科(Coronaviridae). 与GenBank中已知的5个SARS相关病毒全基因组序列的比较分析显示, 已在30个核苷酸位置上检出序列差异, 总体突变率为0.1%, 其中15个变异位点在编码区, 可能会导致蛋白质的氨基酸改变(异义突变). S蛋白中已发现3处可能引起该蛋白质物化特征变化的变异, 而该蛋白质可能参与病毒与宿主间的免疫反应. 与病毒包膜形成相关的M蛋白中则已发现两处氨基酸变化. 进化分析表明, SARS病毒可能不是来源于人类, 但没有证据证明是人为制造的. 为了阐明SARS相关病毒的病因学以及排除其他可能的SARS病原体的存在, 仍需进行更深入的研究.     

鸡传染性支气管炎冠状病毒北京分离株全基因组序列的测定及其特征分析

鸟类传染性支气管炎病毒(AIBV)属于冠病毒科, 冠状病毒属, 是单股线状、正链RNA病毒, 基因组全长近28 kb, 具有3′多聚A尾和5′帽子结构的特征. 采用PCR产物克隆测序和引物步移(primer walking)直接测序结合的方法, 完成了IBV北京分离株的全基因组序列的测定. 该毒株基因组序列全长为27733 bp, 生物信息学分析表明, 它具有10个明显的可读框(ORF); 通过基因定位后其基因排序为: 5′-orf1a-orf1ab-s-3a-3b-e-m-6a-6b-n-3′. 对IBV北京分离株的全基因组序列, 与报道的IBV及造成人类严重急性呼吸综合征(SARS)的病毒(SARS-CoV)进行了比较分析. 结果表明, AIBV是一种变异较大的病毒, 其全基因组序列与国外公布的AIBV全基因组序列相似性仅有85.2%, 与国内报道的不完整AIBV序列比较, 相似性也只有91.2%; 而与SARS病毒基因组全序列比较, 相似性仅为50.8%, 说明它与SARS-CoV关系不大. 同时, 还使用clustalw 1.81 和 Treeview软件构建了冠状病毒的全序列、S蛋白、M蛋白和N蛋白的系统发生树, 结果表明, 鸡IBV北京分离株是第3组病毒的惟一成员, 它与SARS-CoV存在很大的遗传距离. 这项研究将对我国鸡传染性支气管炎病原的鉴定和疾病的控制起到重要的作用.     

冠状病毒和人类SARS病毒的分子亲缘关系研究

组分矢量方法是一种从全基因组出发, 研究物种亲缘关系的新方法. 本文使用这一方法, 通过对外类群的适当选取, 研究包括SARS病毒的冠状病毒进化关系. SARS病毒作为一个单系, 由于彼此之间的序列相似程度非常高, 难以为其选取适当的外类群. 我们利用核苷酸的突变计数来构造距离矩阵, 并将其超度规化, 在此基础上揭示SARS病毒自身的演变关系. 本文采用了更多的序列和新的方法, 反映了更为详细的冠状病毒进化关系, 使得不同方法的比较成为可能, 为冠状病毒进化关系的研究提供了新的视角.     

中国登革2型病毒反向遗传系统的构建与鉴定

为构建登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的反向遗传系统, 根据已测定的DEN2-43全基因组序列, 利用长链RT-PCR及融合PCR扩增此病毒基因组全长cDNA分子, 并将其克隆至低拷贝载体pWSK29中构建该病毒株的全长cDNA克隆. 将此克隆体外转录后, 经电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒. 结果表明, 获得的基因组全长cDNA克隆具有感染性, 所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及乳鼠神经毒力, 且可稳定传代. 该反向遗传系统的构建为深入探讨登革病毒的致病机理及新型疫苗的研制奠定了基础.     

SARS-CoV蛋白质组的生物信息学及其进化关系

一种新的冠状病毒 SARS-CoV是引起严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)的病原体. 对由SARS病毒全基因组序列推导出的所有蛋白质逐一进行分子量、等电点、分子消光系数等物理化学性质计算, 以及跨膜区和亚细胞定位预测, 辅以保守序列家族数据库搜索, 预测SARS-CoV功能未知蛋白质的功能. 同时, 通过SARS-CoV与其他冠状病毒蛋白质同源序列比较和进化距离计算, 分析SARS病毒的分类地位以及与其他冠状病毒的进化关系. 结果表明, 尽管SARS病毒是不同于其他3组冠状病毒的一种全新冠状病毒, 但在进化关系上更靠近牛冠状病毒BoCoV和鼠肝炎病毒MHV. 为实验测定SARS病毒蛋白质组以及抗SARS疫苗研制提供了参考和帮助.     

深圳口岸输入寨卡病毒的基因和生物学特性分析

2016年2月14日下午,一名从斐济和萨摩亚旅游回国的旅客在深圳皇岗口岸入关时有发热症状,其在旅行期间有蚊虫叮咬史.经过病因筛查和诊断确诊为寨卡病毒感染.本研究利用乳鼠和细胞培养传代,成功从病人血清中分离到致病病原——寨卡病毒,命名为SZ_SMGC-1.分离病毒在电子显微镜下可见圆球形经典黄病毒特征,病毒颗粒直径大小约为50 nm.利用特异性引物扩增并获得了病毒全基因组序列,同源性分析显示:SZ_SMGC-1与我国输入性病例中斐济/萨摩亚来源病毒高度同源,同源性均为99.9%,与委内瑞拉来源病毒同源性在99.0%~99.4%之间.研究显示,寨卡病毒进化为亚洲和非洲2个分支.进一步遗传进化分析表明,SZ_SMGC-1毒株与近期我国分离毒株同属于亚洲分支;SZ_SMGC-1与斐济/萨摩亚来源病毒聚类在一个亚分支;委内瑞拉来源的病毒除我国首个病例处于单独的小分支外,其余病毒全部聚类到另一个小分支.生物学特性研究显示,SZ_SMGC-1寨卡病毒可以在蚊虫来源C6/36细胞和哺乳动物来源Vero,BHK-21细胞中生长,感染Vero和BHK-21细胞后可见明显病变并形成典型噬斑.值得注意的是,相同细胞系的不同细胞克隆株对寨卡病毒的敏感性不同.寨卡病毒感染敏感哺乳动物细胞系的建立,对病毒致病机制的深入研究及相关疫苗和药物的研发奠定了基础.寨卡病毒在我国的输入,给我国寨卡疫情防控带来了严峻挑战,必须提早采取灭蚊等防控措施,加紧对疫苗和相关药物的研发,做好预防寨卡流行的技术储备.     

鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的基因组特点

在完成鸡减蛋综合征病毒中国株ＡＡ２全基因组核苷酸序列测定的基础上,对其基因组的结构特点进行了分析,结果表明：ＡＡ２株基因组具有腺病毒科成员的某些结构特点,尽管核苷酸及氨基酸序列的同源性较低但是位于Ｅ２区中编码与病毒繁殖和基因具有复制相关的一些酶类或调节蛋白,以及组装病毒颗粒所需的结构蛋白等与其他腺病毒相似。     

用于SARS冠状病毒检测的60 mer寡核苷酸基因芯片的设计及应用

设计并应用60 mer寡核苷酸基因芯片实现对SARS冠状病毒的检测. 根据寡核苷酸基因芯片的原则设计出30条60 mer的寡核苷酸片段, 覆盖SARS冠状病毒(以最先提交全序列的TOR2株作为参考, GenBank登录号: AY274119)全基因组, 点样制备成12×12的寡核苷酸基因芯片, 从临床诊断SARS患者痰液标本抽提病毒RNA, 采用限制性显示技术进行标记, 将标记好的样品与芯片杂交, 洗脱, 扫描. 初步探索寡核苷酸芯片诊断SARS冠状病毒的可行性. 杂交结果表明, 来自SARS患者样品与芯片上的多个SARS探针杂交, 出现了明显的荧光信号; 阴性和空白对照探针上没有杂交信号, 而对照样品仅与3个SARS探针有杂交. 由此可知, 采用60 mer寡核苷酸基因芯片可以从基因水平实现对SARS冠状病毒多段序列的平行检测, 对于提高检出率有一定意义, 此外, 尚可用于监测在发病过程的各个阶段中病毒基因的活动状况.     

猪瘟病毒石门株全基因组cDNA文库构建、序列测定及分析

根据已发表的猪瘟病毒序列 ,设计并合成了 1 8对覆盖全长基因组的引物 .应用RT PCR技术从猪瘟病毒石门株感染的猪血中扩增出各相应的cDNA片段 ,分别克隆 ,构建了石门株全基因组的cDNA文库并完成了序列测定 .石门株基因组全长 1 2 2 98nt,其中 5′端和 3′端非编码区长度分别为 373和 2 31nt,中间一个大的开放阅读框长 1 1 6 97nt,翻译成一个包含3898个氨基酸残基的多聚蛋白 .还对石门株序列与其他猪瘟病毒序列进行了分析比较     

基于全基因组比较的SARS冠状病毒种系进化分析

SARS(severe acute respiratory syndrome)冠状病毒已被世界卫生组织确认为SARS传染病的病原体, 它的全基因组测序工作分别由中国、加拿大、美国等国的研究小组完成. 然而它的起源仍是一个谜. 为了探寻SARS冠状病毒的来源, 基于FDOD(function of degree of disagreement)方法, 对12个SARS冠状病毒分离株和12种以往发现的冠状病毒进行了全基因组比较, 构造出种系进化无根树. 结果表明, 这两类病毒(分别由12个SARS冠状病毒分离株和12种以往发现的冠状病毒构成)虽然都来自冠状病毒属, 但它们位于两个不同的进化分支上. 冠状病毒属中的3个组被准确地重构. 根据得到的结果, 推测SARS冠状病毒更类似于第一组中的冠状病毒. 根据种系进化树的拓扑结构和各SARS冠状病毒分离株与造成香港Metropole饭店疫情的SARS冠状病毒株之间的联系, 推测各SARS冠状病毒分离株分别位于进化树上两个大的分支, 这为SARS的流行病学研究提供了辅助信息.     

福氏2a志贺氏菌301株基因组水平的缺失基因分析

在完成福氏2a志贺氏菌 301株全基因组序列测定工作的基础上, 以非致病性大肠杆菌K12 MG1655株的全基因组序列为参比对象, 进行比较基因组学分析. 结果显示, 与大肠杆菌基因组相比, 福氏2a志贺氏菌 301株基因组中共有136个长度大于1000 bp的片段缺失, 总长为717253 bp. 这些缺失片段中共包含670个可读框(ORF). 通过对ORFs编码产物的功能预测和分析, 发现这些缺失的ORFs主要编码与细菌代谢相关的酶类、结构蛋白、基因转录调控因子以及与细菌遗传物质水平转移相关的元件. 这不仅从全基因组水平揭示了两种具有不同生物学特性和表型的重要肠道细菌的分子差异, 而且为进一步探索其生理活动过程、致病机制以及肠道细菌间的进化等诸方面的问题提供了有价值的线索.     

籼稻(Oryza Sativa ssp. indica)全基因组框架序列

水稻基因组序列中蕴藏着生理、遗传、发育、进化和与重要经济性状相关的许多生物学信息. 籼稻亚种Oryza Sativa ssp. indica在中国和亚洲其他地方广泛种植. 通过全基因组霰弹法, 得到了这一亚种的基因组框架序列. 共完成430万个成功反应, 总读长为2214.9 Mb, 其中籼稻亚种93-11的成功反应有330万个, 总读长1797.4 Mb, 初步拼接得到了409.76 Mb的非冗余序列, 大约覆盖了水稻全基因组的95.29%, 碱基准确率大于99%. 通过与公共数据库中籼稻indica和粳稻japonica亚种的BAC克隆比较, 证实了基因组框架图的覆盖率、序列分布的随机性和拼接软件BIG-ASSEMBLER的准确性. 在框架图中, 鉴定了96.3%的全长cDNA, 96.4%的遗传标记(STS, STR, RFLP), 94.0%的EST和94.9%的单基因簇(unigene). 初步分析表明, 该框架序列已经达到了国际同行所认同的标准. 框架图的公布无疑为水稻生物学研究提供了基因组学和遗传学方面的基本信息.     

牛Ⅰ型疱疹病毒感染性细菌人工染色体的构建和gN基因缺失病毒的细胞繁殖特性

通过同源重组将pHA2质粒插入到牛Ⅰ型疱疹病毒ZJ分离株基因组的UL15和UL18基因之间, 构建了重组病毒rBHV1-HA; 提取重组病毒的环状基因组DNA, 转化大肠杆菌DH10B, 获得了含有BHV1全基因组的感染性细菌人工染色体克隆pBHV1. pBHV1转染MDBK细胞可以拯救出病毒, 该病毒与野生毒株在细胞上的繁殖特性未见差异. 通过两步Red E/T重组, 构建了gN基因跨膜区缺失的pBHV1突变体, 并转染获得了重组病毒rBHV1-?gN. 病毒繁殖动态曲线显示, rBHV1-?gN的滴度比野生毒株低9%~20%. BHV1感染性克隆的成功构建, 将为研究新型BHV-1基因缺失疫苗和牛的病毒载体疫苗提供技术平台.     

SARS相关病毒与鼠肝炎病毒S蛋白的同源暗示一个潜在受体结合区的存在

最近, 一种新的冠状病毒被确定为近期爆发的严重急性呼吸综合征(SARS)的病原体. 虽然人们对人冠状病毒229E已经有了较多的研究, 而且其受体结合位点也被确定在S蛋白第417~547个氨基酸残基之间. 但是, 这一区域与新分离的SARS相关病毒(香港株, CUHK-W1)没有任何同源性. 有意思的是, 已知的各种冠状病毒S蛋白S1亚基的序列比对和进化分析显示, 鼠肝炎病毒(MHV)与SARS相关病毒的同源性最高. 而且, MHV的S蛋白上负责受体结合的重要位点(第62~65和第214~216位氨基酸残基)与SARS相关病毒的相应区域(第51~54和第195~197位氨基酸残基)高度同源. 这些生物信息学的分析结果可能对研究SARS相关病毒的受体结合位点和病毒侵染靶细胞的机理有所帮助, 进而为设计抗病毒药物和疫苗提供新靶点.     

籼稻(Oryza Sativa ssp. indica)

水稻基因组序列中蕴藏着生理、遗传、发育、进化和与重要经济性状相关的许多生物学信息,籼稻亚种Oryza Sativea ssp.indica在中国和亚洲其他地方广泛种植,通过全基因组霰弹法,得到了这一亚种的基因组框架序列,共完成430万个成功反应,总读长为2214．9Mb,其中灿稻亚种93－11的成功反应有330个,总长1797．4Mb,初步接接得到了409．76Mb的非冗余序列,大约覆盖了水稻全基因组的95．29％,碱基准确率大于99％。通过与公共数据库中籼稻indica和粳稻japonica亚种的BAC克隆比较,证实了基因组框图的覆盖率、序列分布的随机性和拼接软件BIG－ASSEMBLER的准确性,在框架图中,鉴定了96．3％的全长cDNA,96．4％的遗传标记（STS,STR,RFLP）,94．0％的EST和94．9％的单基因簇（unigene）,初步分析表明,该框架序列已经达到了国际同行所认同的标准,框架图的公布无疑为水稻生物学研究提供了基因组学和遗传学方面的基本信息。     

SARS-CoV对幼年和成年布氏田鼠的感染研究

采用鼻腔喷雾法(CCID₅₀ = 10^5.7)研究了SARS冠状病毒(SARS-CoV)对成年和幼年布氏田鼠的感染效果. 成年动物攻毒后出现死亡, 表现为口鼻有出血, 肠道出血; 肺组织呈出血性间质性肺炎改变, 肝、脾、肾、胰腺组织均呈淤血性改变; 存活动物肺组织呈间质性肺炎, 局灶出血及肺气肿改变, 其他脏器未见明显病变. 幼年动物攻毒后未见死亡但行动较为迟缓, 主要脏器未见明显异常; 早期肺组织有局限性肺炎改变, 且病毒分离为阳性; 同居对照组的一只动物有肺组织局灶性肺炎. 结果表明, SARS-CoV可以很强地感染布氏田鼠; 成年布氏田鼠比幼年动物对SARS-CoV更敏感; 布氏田鼠有望成为一种比较理想小型SARS动物模型.     

基于ISSR, AFLP分子标记和cyclins基因克隆的异源四倍体鲫鲤进化分析

为了解两性可育、遗传性状稳定的异源四倍体鲫鲤基因组的进化情况, 用ISSR, AFLP分子标记及cyclin A1和B1基因克隆的方法, 从多倍体基因组和单个基因在多倍体形成前后的变化两个角度对上述问题进行了探讨分析. 研究结果表明, 异源四倍体鲫鲤经过连续15代培育, 仍然保持了原始亲本遗传性状的稳定性, 但基因组的遗传相似性及cyclins基因的碱基变异水平都说明异源四倍体鲫鲤具有明显的偏母性遗传特性. ISSR和AFLP分析表明, 在异源四倍体鲫鲤基因组中, 除了新产生的、原始亲本中没有的DNA条带外, 还发生了原始亲本的DNA带纹消失, 而且消失的带纹倾向于父本基因组. cyclins基因序列分析表明, 在异源四倍体鲫鲤不同于原始亲本的核苷酸变异位点中, 由于存在密码子单个碱基的非同义突变导致了异源四倍体鲫鲤新的氨基酸位点的产生. 异源四倍体鲫鲤上述基因组的非加性变化, 可能是应对杂交和多倍化冲击而使其趋于遗传稳定的一种适应性变化.     

红细胞天然免疫与获得性免疫

机体防御系统,按免疫功能可分为天然免疫和获得性免疫两大功能,而红细胞具有多种天然免疫分子,是重要的天然免疫细胞.红细胞不仅参与天然免疫反应,对某些致病原有杀伤性效应细胞样作用,而且参与淋巴细胞获得性免疫反应调控,红细胞各种天然免疫分子之间以及与淋巴细胞免疫功能之间有固定的正负相关性,即所谓的免疫平衡性,一当红细胞天然免疫与获得性免疫相关性失平衡,则将处于疾病状态,在开拓红细胞天然免疫原创性研究领域方面,我国已取得了显著成绩.如在SARS暴发期,在探讨红细胞天然免疫检测技术在早隔离、早防治的应用方面已取得了令人关注的良好效果,说明红细胞天然免疫原创性研究具有广阔的前景.红细胞具有天然免疫功能已被学术界公认,但红细胞天然免疫与获得性免疫之间的分工与合作及其重要性,还需深入研究,本文设想由浅入深,介绍有关这方面的研究进展,分四个方面介绍:①有关体内防御系统的分工;②红细胞天然免疫功能调控获得性免疫反应的物质基础、机制及其意义;③我国红细胞天然免疫与白细胞免疫相关性应用研究进展;④开拓红细胞天然免疫原创性研究领域展望.     

志贺氏菌属各亚群菌株基因组“共有骨架”组成的分析

不同原核生物在基因组组成上的差异是其生物学性状差异的基础. 然而，进化中亲缘关系较近的菌群, 其基因组除了含有群或株特异的基因外, 还含有反映它们起源和进化痕迹的“共有骨架”结构, 而这些“共有骨架”恰恰是它们基本生存能力和共有生物学性状的基础. 志贺氏菌在起源和进化上与大肠杆菌极为密切, 目前倾向于将二者划为同一个种. 利用大肠杆菌K-12全基因组及Sf301特异性ORFs的芯片研究了志贺氏菌4个群间的基因组组成. 结果显示, 分别有16%~22% K-12的ORFs序列没有在志贺氏菌的基因组中被检测出, 而志贺氏菌的基因组中包含至少2800个保守的ORFs, 组成了其共有的“共有骨架”. 进一步分析提示, 这些“共有骨架”是维持肠道细菌正常生命生理活动所必需的基本组成. 此外, 只有20%的Sf301特异性ORFs同时存在于其他3个菌株中, 揭示了各菌株间基因组的异质性和菌属内的遗传多样性.     

赛葵黄脉病毒: 一种含有卫星DNA的双生病毒新种

从云南红河地区表现黄脉症状的杂草——赛葵上分离到病毒分离物Y47. 对Y47进行DNA-A的全序列测定, 结果表明, Y47 DNA-A全长2731个核苷酸, 基因组具有典型的双生病毒科病毒特征, 即编码6个ORFs, 其中病毒链编码AV1(CP)和AV2共2个ORFs, 互补链编码AC1~4共4个ORFs. 对基因组进一步比较发现, Y47 DNA-A与秋葵黄脉花叶病毒分离物201(GenBank登录号: AJ002451)的同源性最高, 达77%, 而与其他双生病毒的同源性均在76%以下, 表明Y47是双生病毒的一个新种, 命名为赛葵黄脉病毒(MYVV). 利用DNAβ的特异性引物beta01和beta02, 从Y47中扩增到卫星DNA分子(Y47β). 序列分析表明, Y47β全长1348个核苷酸, 至少在其互补链上编码一个有功能的ORF(C1). Y47β的全序列与Multan棉花曲叶病毒和Rajasthan棉花曲叶病毒的DNAβ的核苷酸同源性最高, 为62%~67%, 而与其他已报道的DNAβ的同源性均低于46%. 系统关系树分析表明, 卫星DNAβ分子与其辅助病毒是共同进化的.