甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因中间缺失突变体的构建

根据NCBI中EU278617序列设计引物,利用甘蔗SPSG2菌液为模板,扩增SPS8-11并克隆到T载体后测序.通过排除野生型DNA的定点突变PCR方法获得SPS8-11中第8内含子缺失TGCATG的突变体pMD-SPS8-11-A,酶切后测序鉴定.成功构建了甘蔗SPS8-11中间缺失突变体pMD-SPS8-11-A.     

黑莓果实发育过程中蔗糖磷酸合成酶基因的表达分析

【目的】蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)是调控植物蔗糖代谢合成的关键酶,在植物光合产物的积累与分配方面有重要作用。本研究旨在探讨黑莓3个SPS基因的系统发育关系、编码的蛋白特性、在不同发育时期、不同组织中的时空表达特性,并分析其与黑莓发育的关系。【方法】以黑莓栽培品种‘宝森’(‘Boysenberry’)为试材,从中克隆和鉴定了3个 SPS 基因家族成员,利用生物信息学和荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)等方法对3个黑莓SPS 基因RuSPS1、RuSPS2和RuSPS3的氨基酸序列、保守作用元件、编码的蛋白特性、蛋白结构及进化关系进行分析,并对这3个基因在黑莓中的时空表达情况与酶活性进行了相关性分析。【结果】多重氨基酸序列比对显示,黑莓SPS蛋白具有植物SPS家族特有的2个保守蛋白结构域及2个相对保守的蛋白磷酸位点;系统进化分析表明,RuSPS基因分为A、B两个亚族,其中RuSPS1和RuSPS3为A亚族成员,RuSPS2为B亚族成员;保守作用元件分析表明, 除RuSPS2含基本的蛋白保守元件外, RuSPS1和RuSPS3都存在不同程度的片段缺失;序列分析和比较揭示了黑莓SPS基因与其他家族的不同特征。qRT-PCR分析显示,3个RuSPS基因在黑莓各个组织器官中均有表达,其中RuSPS1在叶片和果实中表达量较高,在花中的表达量较低;RuSPS2在发育成熟的果实中有大量的表达,在其他器官中表达量较低;RuSPS3在各器官中的表达均较高,说明 SPS基因表达具有明显的组织特异性,3个RuSPS基因都随着果实发育进程在果实和叶片中表现了表达增加的趋势。果实和叶片中SPS酶活性的变化与RuSPS基因表达水平一致。相关分析表明,叶片中SPS活性与RuSPS2显著正相关(P<0.05),果实中SPS活性与RuSPS1显著负相关(P<0.05)。【结论】3个RuSPS基因与黑莓果实发育过程中的蔗糖合成与代谢关系密切,均参与了黑莓的生长发育调控,其中叶片中SPS活性的变化一定程度上是由RuSPS2调控,果实中SPS活性的变化则是由RuSPS1调控。     

甘蔗SPS Ⅲ启动子区ATCT-motif和CAT-box元件的酵母单杂交报告载体构建

蔗糖磷酸合成酶是植物蔗糖代谢中关键限速酶之一,为了更具体分析光响应元件ATCT-motif与分生组织特异性元件CAT-box的功能,将含有ATCT-motif和CAT-box的SPSⅢ5’侧翼序列(-1 320～-1 210),顺式作用元件SPSⅢ-AB,构建应用酵母单杂交体系的诱饵报告载体pAbAi-SPSⅢ-AB,并转化进酵母,为进一步探讨SPSⅢ基因的调控序列奠定基础.     

苦参碱对小麦旗叶中蔗糖磷酸合成酶活性的调节

小麦旗叶中碳水化合物水平将影响穗的生长和物质的积累 .本文实验结果表明苦参碱对小麦旗叶蔗糖生物合成有明显的影响 ,并与叶片中蔗糖磷酸合成酶和酸性转化酶活性变化有关     

筛选甘蔗SPSⅢ启动子诱饵片段结合蛋白的酵母单杂交诱饵质粒的构建

主要构建了可以与酵母染色体发生重组的质粒pAbAI-Bait,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞获得转化子,将阳性克隆进行PCR与DNA测序的方法鉴定,结果表明: 酵母单杂交中报告质粒pAbAI-Bait构建成功,可用于酵母单杂交体系.     

作物叶中蔗糖磷酸合成酶的生物学功能与调控的研究进展

介绍转蔗糖磷酸合成酶(SPS)的基本理化特性及SPS基因的克隆情况,综述利用转基因SPS植株研究作物叶中的SPS对光合作用产物的分配积累以及对作物的生长、发育、产量、品质、氮素转运的影响,以及SPS对高浓度二氧化碳的反应和SPS活性的调控等方面的研究进展.提出今后SPS的研究重点应该围绕解析SPS和磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)之间的关系,以及选育用于生产生物质能源的转SPS基因的甘蔗和木薯品种等方面开展.     

以潮霉素B磷酸转移酶基因为遗传标记的启动子探针型载体的构建

用来自大肠杆菌的潮霉素Ｂ磷酸转移酶基因（ｈｙｇｒ）作为遗传标记构建了启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ８,该基因的转录和翻译起始区以及５’－端编码区两个密码子均被除去,载体骨架为大肠杆菌质粒ｐＵＧＶ２,该标记基因的终止子来自Ｐｈａｎｅｒｃｈａｅｔｅｃｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ的ＬＩＰ６基因     

转蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶基因提高烟草的耐旱性

蔗糖: 蔗糖-1-果糖基转移酶（sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase, 1-SST）以蔗糖为底物催化生成蔗果三糖等低聚合度的果聚糖.将从莴苣中克隆的1-SST基因重组到pCAMBIA1300-als中,构建了在CaMV 35S启动子调控下的植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘转化法将1-SST基因导入烟草中,PCR和Southern杂交检测表明获得了转基因植株,RT-PCR结果表明该基因在烟草中正常表达. 对T₀代转基因烟草进行的耐旱性分析结果表明,干旱胁迫6d的转基因植株丙二醛含量和电解质渗漏率显著低于未转基因对照,叶片相对含水量下降速度也明显比对照慢. 对转基因植株叶片糖分分析表明,转基因烟草植株积累果聚糖,并在干旱胁迫后含量明显增加,而未转基因对照植株不积累果聚糖. 在14%PEG溶液中未转基因烟草种子的萌发率仅为转基因烟草种子的一半;在附加200mmol/L甘露醇的培养基中未转基因烟草种子根的生长明显受到抑制,而转基因烟草根的生长发育正常. 以上研究结果表明,转1-SST基因烟草植株耐旱性的提高可能与该基因的表达有关.     

以潮霉素B磷酸转移酶基因为遗传标记的启动子探针型载体的 …

用来自大肠杆菌的潮霉素Ｂ磷酸转移酶基因作为遗传标记构建了启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ８，该基因的转录和翻译起始区以及５‘－端编码区两个密码子均被除去，载体骨架为大肠杆菌质粒ｐＵＧＶ２该标记基因的终止子来自Ｐｈａｎｅｒｃｈａｅｔｅ ｃｙｓｏｓｐｏｒｉｔｍ的ＬＩＰ６基因。     

酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建

以从原核表达载体中酶切得到的tps1基因为模板，设计适当的引物，利用PCR技术，克隆出核苷酸数大约1.5k的片段，PCR产物经回收后，与PCAMBIAI303载体连接并转化大肠杆菌DH5a，阳性重组子经PCR鉴定，结果表明已获得海藻糖磷酸合成酶基因的植物表达载体。     

水稻磷转运蛋白基因OsPht1;6启动子表达载体转化系统的建立

通过PCR从粳稻（Oryza sativa L.cv.ssp.Japonica）的总DNA中扩增出一个磷转运蛋白基因（Phosphates transporter1;6;OsPht1;6,accession no AF536966）的启动子序列.以此为基础与二元表达载体PS1aG-3构建含Pht1;6启动子的植物表达载体,并通过根癌农杆菌介导转化了水稻武运粳7号品种.同时,对其愈伤组织高效再生体系和影响报告基因GUS瞬时表达的各种因素也做了比较研究.结果表明：①诱导水稻武运粳7号品种愈伤形成,3 mg/L 2,4-D的生长素浓度最适宜;②GUS基因高瞬时表达频率的条件为：工程菌液的浓度OD600值为0.7-0.8,浸染时间30 min,共培养时间3 d.利用这些再生转化条件,以EHA105为菌株转化浸染愈伤组织,获得了较高频率的Pht1;6启动子驱动的GUS基因瞬时表达.这些方法都有效地提高了抗性愈伤组织的形成率,该实验获得了转基因植株,经PCR检测,证实已将目的基因整合到水稻的基因组中.     

GUS和HPT基因的基因枪法转化水稻

以水稻（丹粳－５号）愈伤组织为受体材料，采用基因枪法将含有ＧＵＳ和ＨＰＴ基因的ＣＭ２质粒导入水稻细胞．经过５０ｍｇ／Ｌ的潮霉素筛选，获得抗性愈伤组织，并在同样筛选压力下诱导分化成苗，获得抗性苗．共获得１７个抗性克隆．ＧＵＳ组织化学检测表明，有１２个克隆为ＧＵＳ阳性，ＧＵＳ和ＨＰＴ基因共表达率为７０％左右．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分子检测证明ＨＰＴ基因已整合到水稻基因组中．     

水稻Rho家族OsRac2启动子的转基因功能鉴定

采用PCR扩增的方法,构建了OsRac2基因转录起始位点上游1.7 kb的启动子5′缺失植物表达载体,转化烟草并筛选阳性转基因植株.以多种激素处理转基因烟草,通过组织化学分析和GUS荧光活性的检测,证实Os-Rac2启动子上存在着一些激素应答元件,该基因的表达可能受茉莉酸的正调控,脱落酸等激素的负调控.     

烟草NFL1基因启动子区的克隆和初步的功能分析

植物的开花过程是一个复杂的发育过程,涉及到许多基因的表达和调控,其中LFY同源基因(LFY-like genes)发挥着重要的作用[1～7].在拟南芥中,LFY基因发生突变而失去功能后,花芽分生组织的形成受到显著的抑制[8];将LFY基因在植株中的表达水平提高后则可以有效地促进开花[9].     

毛白杨4CL基因启动子的克隆及初步功能分析

4CL(4-coumarate:CoA ligase,4-香豆酸:辅酶A连接酶)在植物木质素合成途径中催化羟基香豆酸生成羟基肉桂酰CoA,主要在木质部中表达,对植物木质素生物合成具重要调控作用.为研究4CL基因启动子在转基因植物中的表达特性,探索其在植物基因工程研究中的潜在应用价值,利用PCR方法从毛白杨基因组DNA中扩增得到了4CL启动子片段.序列分析表明与美洲山杨(P.tremuloids)的4CL启动子同源性为95%.采用生物信息学方法对该序列进行分析.与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的瞬时表达检测可见明显GUS活性.     

Promoter of soybean early nodulin gene<Emphasis Type="Italic">enod2B</Emphasis> is induced by rhizobial Nod factors in transgenic rice

Nod factors, which are signaling molecules produced by Rhizobia, are the principal determinants of host specificity in Rhizobium-legume symbiosis. Nod factors can elicit a number of characteristic developmental responses in the roots of legumes, such as depolarization of the membrane potential in epidermal cells, specific expression of early nodulin genes and changes in the flux of calcium in root hairs, deformation of root hairs, cell division in the root cortex and formation of the nodule primordinm. Whether the rice plant can respond to signaling molecules (i.e. Nod factors) is an important question, as it could establish the potential for symbiotic nitrogen fixation in rice. The promoter of the soybean (Glycine max) early nodulin gene Gmenod2B fused to the β-glucuronidase (GUS) reporter gene was used as a molecular marker to explore whether Nod factors can be recognized by rice cells as signaling molecules. Transgenic rice plants harboring the chimeric gene Gmenod2BP-GUS were obtained via an Agrobacterium tumefaciens-mediated system. NodNGR factors produced by a broad-host-range Rhizobium strain NGR234(pA28) were used as probes to investigate the activity of the Gmenod2B promoter in rice. Our results showed that the early nodulin gene Gmenod2B promoter was induced by NodNGR factors in transgenic rice, and that it was specifically expressed in rice plant roots. Moreover, GUS gene expression driven by the Gmenod2B promoter in transgenic rice was regulated by nitrogen status. These findings indicated that rice possessed the ability to respond to Nod factor signals, and that this signal transduction system resulted in activation of the Gmenod2B promoter. Thus, we predict that the Nod-factor inducible nodulin expression system, which is similar to Rhizobium-legume symbiosis, may also exist in rice.     

AtNCED3及AtAAO3基因启动子功能分析及其驱动CHS基因表达

NCED3及AAO3系ABA信号积累的关键基因,其转录调控研究是细胞ABA信号精细调节及植物抗逆分子机制阐明的关键.通过NCED3及AAO3启动子结构与功能的分析,建立了NCED3及AAO3启动子驱动CHS基因表达受干旱诱导致烟草花色变化的体系.     

水稻RSSG8基因启动子与GUS融合基因的构建及在烟草中的瞬间表达

使用染色体步移(Genome walking)法,从籼稻(Oryza sativa subsp．indica)桂朝2号基因组中克隆到长度为471bp的水稻精细胞优势表达基因RSSG8的启动子片段R8PN,并进行了全序列测定和分析．该段序列中含有3个CAAT-box,6个Gobox和多种植物顺式作用元件,但没有发现典型的TATA-box,推测为一种特殊的启动子结构,为了鉴定RSSG8基因的基本启动子元件,将二条长度不同的5’端侧翼区缺失体(分别长471bp,260bp)定向插入载体pBI121中,取代原有的CaMV 35S启动子,构了驱动报告基因GUS的植物表达载体pRGUS1,pRGUS2,通过农杆菌介导的瞬时表达法转化烟草叶片和花粉,快速鉴定启动子片段中起关键作用的区域,结果显示两个缺失片段都能启动GUS的表达,可以初步判定这两个片段具有启动子功能。     

小鼠液胞H~+-ATPase 15 K启动子(M15 K)的克隆及其在植物体内的表达特性研究

PCR克隆了小鼠液胞H+-ATPase 15K启动子,构建具有Kan抗性和GUS intron报告基因的植物表达载体LpPMG.通过M15K启动子指导的GUS intron基因在烟草叶片内的瞬时性表达,比较了其植物表达特性.结果表明:M15K启动子可启动GUS在植物体内的表达.其表达活性相当于2×35S启动子的87.0%±17.3%.