CD226分子siRNA慢病毒载体的构建和鉴定

为设计筛选针对人CD226分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对Jurkat/E6细胞膜表面天然CD226分子表达水平的影响,首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与CD226分子真核表达载体共同转染293T细胞,挑选出最有效抑制CD226表达的序列。应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因CD226的siRNA慢病毒载体。使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清,感染Jurkat/E6细胞系,对病毒感染效果进行检测。结果在4条针对CD226分子设计的siRNA序列中,siRNA—513最为有效的抑制了外源性CD226分子的表达,带有该序列的慢病毒载体pLKO—CD226可以完全抑制Jurkat/E6细胞上天然分子的表达。说明应用基因工程技术成功构建了针对CD226分子的RNA干扰慢病毒载体,为深入研究人类黏附分子CD226在机体免疫功能方面提供了技术支持。     

Cyclin E分子siRNA慢病毒载体的构建及其对骨肉瘤细胞系sosp9607的影响

设计筛选针对人cyclin E分子的siRNA序列,构建相应的siRNA慢病毒载体,检测其对骨肉瘤细胞系Sosp9607胞内cyclin E分子表达水平的影响.首先设计并合成4对siRNA双链寡聚核苷酸,与cyclin E分子真核表达载体共同转染293T细胞.挑选出最有效抑制cyclin E表达的序列,应用基因工程技术,将该序列连接于慢病毒载体pLKO.1中,构建携带针对目的基因cyclin E的siRNA慢病毒载体pLKO-CE.使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒载体共转染293T细胞,收获病毒上清,感染Sosp9607细胞系,对病毒感染后抑制cyclinE表达的效果进行检测.结果在4条针对cyclin E分子设计的siRNA序列中,siRNA-464最为有效的抑制了外源性cyclin E分子的表达;带有该序列的慢病毒载体pLKO-CE可以完全抑制Sosp9607细胞中天然分子的表达,引起Sosp9607细胞生物学行为的改变:G1期细胞增多,S期减少,细胞增殖受抑制.说明应用基因工程技术成功构建了针对cyclin E分子的RNA干扰慢病毒载体,可有效抑制骨肉瘤细胞cyclin E的表达,使肿瘤细胞增殖减缓,为深入研究针对cyclin E的基因治疗方案的临床前实验研究提供了实验证据和理论依据.     

在Hep G2细胞中利用siRNA沉默GFP基因的实验探讨

目的:通过探讨小分子双链RNA(siRNA)通过RNA干扰(RNAi)机制沉默肝癌细胞株Hep G2荧光素报告基因GFP的各项生物学指标,为进一步实验和临床研究提供依据.方法:通过体外实验,对siRNA和siRNA脂质体的稳定性和细胞毒性进行评估;通过荧光标记技术,研究不同时间siRNA脂质体的转染效率;通过荧光显微镜下观察转染细胞和RT-PCR检测靶基因mRNA表达,确定不同种类、形式、剂量的siRNA对靶基因的沉默效能.结果:在空白培养液中,siRNA和siRNA脂质体可稳定至4h,在5%血清中2～4h后明显降解;100nM的siRNA和siRNA脂质体无明显细胞毒性;siRNA脂质体转染细胞株的效率随时间不同而不同,4h可达90%;非特异性siRNA/脂质体无沉默靶基因表达作用,特异性siRNA/脂质体对靶基因的沉默作用在一定范围内随剂量升高(20nM、50nM、100nM)而升高.结论:siRNA的稳定性可满足实验需要,且无明显细胞毒性,特异性siRNA转染肝癌细胞株能有效抑制靶基因表达,用脂质体转染可提高转染效率.siRNA通过RNAi机制沉默靶基因表达,为肿瘤的治疗和基础研究提供了新的工具和思路.     

RNAi技术的研究进展及其应用

RNA干扰（RNAi）是指双链RNA引起的mRNA水平互补序列基因表达的关闭,即序列特异性转录后基因沉默,是生物体进化过程中抵御外未基因和病毒感染的进化保守机制。本文对RNA干涉现象的发现,作用机制及各方面应用作了简单的论述。     

慢病毒介导的RNA干扰抑制白血病细胞增殖的应用

通过慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,沉默成人T细胞白血病(ATL)中关键的病毒基因HBZ,并研究RNA干扰后对白血病细胞增殖的影响.首先根据HBZ基因序列设计RNA干扰片段,构建其慢病毒载体,并将其包装成病毒.然后用HBZ siRNA慢病毒感染白血病细胞株TL-Om1,通过RT-PCR和Western blot检测HBZ基因和蛋白表达情况,MTT技术检测沉默HBZ后TL-Om1细胞的增殖情况,利用RT-PCR检测病毒感染后下游生长相关基因的表达.实验结果表明:利用慢病毒介导的RNA干扰技术能有效降低HBZ的表达,进而抑制了白血病细胞的增殖;沉默HBZ后,细胞内E2F1,PCNA和Myc等下游生长相关基因的表达受到了明显抑制.这将为慢病毒介导的RNA干扰技术应用于临床治疗成人T细胞白血病提供重要的实验依据.     

RNAi在胃癌研究中应用的进展

胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，其发病率在恶性肿瘤中占第四位，死亡率居第二位，且胃癌发病率在世界不同国家和地区有较大的差异，表现出明显的地域性。RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）在哺乳动物细胞中是利用小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）诱导特异性基因表达抑制，具有基因抑制效果确切、抑制具有严格的序列特异性、作用迅速等特点，已被广泛用于胃癌相关基因功能、胃癌化疗的多药耐药、胃癌的治疗方面的研究和探索。随着对RNAi机制的深入研究，相信不久的将来RNAi技术能在肿瘤的基因治疗方面发挥越来越重要的作用。     

RNA干扰及其应用

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA（double—stranded RNA，dsRNA）启动的序列特异的转录后基因沉默过程．在这一过程中，双链RNA被核酸内切酶切割成小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），小干扰RNA与相关的蛋白质结合成RNA诱导沉默复合体（siRNA—induced silencing complex，RISC），RISC识别并降解靶mRNA．现在认为RNA干扰是真核生物共有的抗病毒、抗转座子、抗转基因和抗异常RNA的基因组免疫系统．随着RNA干扰的研究，产生了一种新的技术-RNA干扰技术，并得到了广泛的应用．     

用体外转录法制备小干扰RNA抑制Hela细胞CUEDC2基因表达

CUEDC2是一个广泛表达于各种真核生物、功能尚不明确的基因.利用一种改进的体外转录方法获得包含CUEDC2基因靶序列的长链RNA,进而通过RNA酶H切割引导序列形成成熟siRNA.转染Hela细胞并进行免疫印迹检测.结果显示,运用此方法得到的siRNA能够有效地抑制细胞中内源CUEDC2的表达,此项方法为CUEDC2的深入功能分析奠定了基础.     

布鲁菌感染细胞NF-κB的表达水平检测及其干扰方法研究

目的本文针对布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中NF-κB的表达进行检测,并比较siRNA和shRNA对RAW264.7细胞中NF-κB表达沉默效果。方法根据NF-κB P65基因序列,设计siRNA干扰序列,通过干扰RAW264.7细胞筛选效率较高的siRNA设计shRNA序列,siRNA和shRNA同时干扰布鲁氏菌侵染的RAW264.7细胞,使用RT-PCR方法检测NF-κB P65基因的相对表达情况。结果与阴性对照mock组相比,P65-shRNA组表达降低;P65-siRNA组P65表达低于P65-shRNA组,均低于阴性对照mock组;布鲁氏菌侵染组,P65表达显著高于阴性对照组。结论布鲁氏菌侵染组促进了NF-κB P65的表达,P65-shRNA、P65-siRNA组均抑制了NF-κB P65的表达,siRNA可作为基因沉默中快速筛选的工具,在RNA干扰的应用中可与shRNA配合使用。     

RNA干涉及其在肿瘤研究中的应用

RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默的过程，是一种高效的高特异性抑制基因表达的新途径。通过双链小干涉RNA(siRNA)与一系列蛋白质结合形成siRNA诱导的沉默复合体(RISC)并活化，然后，RISC对靶基因进行识别、降解。与反义方法相比，siRNA具有更好的抑制效果。RNAi的应用将为癌症的基因治疗提供新的方法。     

慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究

主要就慢病毒载体及其介导的RNA干扰技术在基因治疗中的应用研究进行了综述,并对其在该领域具有的广阔前景进行了展望.慢病毒载体作为一种新型的载体,可有效地将携带的目的基因导入宿主细胞,并将其整合到宿主细胞基因组中,从而使目的基因得以持久稳定地表达.该载体因具有高感染性、高表达效率及不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为基因治疗研究中的一个重要工具.RNA干扰技术可以特异性抑制或关闭特定基因的表达,因此该技术可广泛应用在基因功能探究和恶性肿瘤治疗等领域.由慢病毒载体介导的RNA干扰技术能持久、稳定、特异性地抑制各类细胞中特定基因的表达,在病毒感染、肿瘤等疾病的基因治疗中被广泛应用,成为生物医学领域的新热点.     

敲低EYA3基因抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长

为了探讨人眼缺失基因(EYA3)在人视网膜母细胞瘤发生发展中的生物学作用,构建了EYA3小干扰RNA (siRNA)的真核表达载体,并验证敲低效果和观察其对人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞生长的影响.根据人EYA3的cDNA序列,将设计含有小发卡结构的寡核苷酸序列克隆到siRNA表达载体上;将重组质粒转染HEK293T细胞中,通过实时定量RT-PCR及Western印迹检测EYA3基因的表达水平;重组质粒稳定转染人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞并利用生长曲线检测EYA3对其生长的影响.结果表明:构建的siRNA能够抑制EYA3基因的表达,生长曲线验证EYA3 siRNA基因能抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长.最后结论是EYA3 siRNA能够抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长,本实验为进一步研究EYA3在视网膜母细胞瘤中的功能奠定了基础.     

siRNA干扰Survivin基因对结肠癌生物学特性影响

向结肠癌SW480细胞中导入针对Survivin基因的siRNA,研究RNA干扰对SW480细胞增殖和凋亡的影响,为结肠癌的基因治疗提供实验依据,同时寻求新的、有效的RNA干扰片段.设计3条特异性干扰靶向Survivin基因的siRNA,转染24,48,72h后,Western蛋白印迹法检测Survivin蛋白变化,同时噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖.3条siRNA分别作用于SW480细胞,转染24,48,72h后,3组Survivin蛋白表达均出现下调(P<0.05),在48h时达到顶峰,抑制率分别为66.5%±2.1%,49.6%±2.8%和47.8%±3.1%,差异具有统计学意义(P<0.05);MTT法显示Survivin基因沉默后,细胞增殖受到明显抑制.脂质体所介导的体外Survivin siRNA,能有效地沉默结肠癌细胞的Survivin基因,从而抑制结肠癌细胞的增殖和促进细胞的凋亡,特别是针对保守区域设计的靶向siRNA.干扰效果更为显著.     

小分子RNA干扰技术的原理和应用前景

和传统基因抑制工具(如反义寡核苷酸和核酶技术等)比较,RNA干扰是源自细胞的内在的基因沉默机制,抑制基因表达具有广泛、高效和特异等优点.简要阐述了RNA干扰在基因功能分析中的作用和在疾病治疗中的应用前景.     

低表达长非编码RNA MALAT1对人宫颈癌HeLa细胞体外生长和迁移的影响

设计3个针对MALAT1不同靶序列的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA), 筛选出有效的siRNA序列, 设计并构建短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)干扰质粒, 转染到HeLa细胞中, 构建低表达MALAT1的稳定细胞株.通过细胞的生长曲线和细胞划痕实验验证降低MALAT1对HeLa细胞增殖和迁移的影响.结果显示MALAT1表达水平在HeLa细胞中得到有效地降低, 低表达MALAT1的HeLa细胞生长速度和迁移速度减小.表明MALAT1在HeLa细胞中具有调控细胞增殖和迁移的能力     

siRNA分子设计研究进展

为了设计高效的siRNA（Short interfering Ribonucleic Acid）分子、最大限度地减少siRNA分子的脱靶效应（off-target effects），siRNA分子设计已经成为热门研究领域。siRNA分子设计主要是基于序列和能量特征，以及靶标的二级结构特征，基于这些特征设计的siRNA分子已经有了较高的抑制基因表达的效率。RNAi（RNA interference）在
基因发现以及疾病治疗领域已有非常广泛的应用，就siRNA分子设计近年的研究进展作一综述，为今后siRNA研究提供参考。     

RNA干扰技术及其在医学研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用双链RNA(dsRNA)诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象.RNAi主要通过核酸酶Dicer切割dsRNA生成21-23 nt的小干扰RNA(siRNA),继而由siRNA识别并靶向降解同源靶基因mRNA,从而抑制靶基因的蛋白表达.近年来,RNAi技术在医学研究中的广泛应用均取得了显著的基因沉默效果,RNAi以其高特异性、高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段.文中综述了该技术在医学研究中的应用.     

RNA干扰及其在哺乳动物中的应用进展

通过双链RNA(dsRNA)在植物、线虫、果蝇等中进行RNA干扰(RNAi)已获得了很大的成功,但将其应用于哺乳动物却遇到了一定困难.随着各种转染方法的日益改进,以及各种小干扰RNAs(siRNAs)表达载体的出现和不断优化,它们在体内的转录产物(长约21～23nt的双链siRNAs)能特异性抑制哺乳动物基因的表达,使得RNAi应用于哺乳动物系统成为可能. RNAi正在改变以往人们研究哺乳动物细胞基因功能的方式.不仅如此,RNAi正在向病毒、癌症、基因药物研制等方向迅猛发展,文中对RNA干扰及其在哺乳动物中的应用进展进行了综述.     

FTH1在布鲁氏菌侵染宿主细胞中的作用

为了探究布鲁氏菌侵染宿主巨噬细胞过程中铁蛋白(FTH1)生物学功能,本研究根据FTH1蛋白核苷酸序列,分别设计4条特异性小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,亚克隆到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen载体,并转染RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR筛选干扰效果最优的质粒;布鲁氏菌侵染干扰前、后的RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR检测布鲁氏菌基因16S rRNA和细胞凋亡相关基因的mRNA表达量。结果显示:获得了4条特异性siRNA分子,经测序正确,pSIREN-C siRNA质粒对FTH1干扰效果最高可达98%。干扰后布鲁氏菌侵染抑制率为84%,凋亡相关基因的mRNA表达量5个降低,3个上升。本研究表明:FTH1基因沉默后布鲁氏菌胞内的生存能力下降;布鲁氏菌侵染可以抑制细胞凋亡发生,FTH1基因沉默后细胞凋亡升高。     

RNA干扰技术抑制SGIV ICP18绿色荧光融合蛋白表达的研究

 将含有新加坡石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus,SGIV）ICP18基因的真核表达载体pEGFP-ICP18转染到胖头鲤细胞（Fathead minnow cells,FHM）中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP18 GFP融合蛋白呈点状分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIV ICP18的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIV ICP18的siRNA（siRNA ICP18）,与pEGFP ICP18共转染到FHM细胞中,通过荧光显微镜观察不同时间点的荧光强度变化。与序列非特异性siRNA（siRNA negative）阴性对照相比,转染后24~48 h,共转染siRNA ICP18和pEGFP ICP18的实验细胞中发荧光的细胞数量较阴性对照少60%~80%左右,说明体外化学合成的siRNA-ICP18可有效抑制FHM细胞中外源导入SGIV ICP18基因的表达。