耐热性重组Taq DNA酶的制备及鉴定

利用含Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化大肠杆菌E.coli菌株,用异丙基硫代-β-D-乳糖苷(IPTG)诱导10～12h表达耐热Taq DNA聚合酶;然后溶菌酶、NP40裂解细菌;硫酸铵沉淀、4℃下透析;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、考马斯亮蓝法和PCR分析其纯度、浓度和活性。结果表明分离纯化制备的耐热性Taq DNA聚合酶,其纯度、浓度和活性均可与同类产品相比,比活性达20000U/mg,能有效扩增出DNA片段。     

稀土离子对TaqTMDNA聚合酶的抑制机理

在PCR扩增水平上研究了La^ 3和Ce^ 3对Taq^TMDNA聚合酶的抑制机理,采用动态荧光比色法测定PCR扩增产物浓度，证明了La^ 3和Ce^ 3在10～50μmol／L抑制DNA复制是由于其抑制了Taq^TMDNA聚合酶的活性所致,且该抑制属竞争性的抑制，得到了La^ 3和Ce^ 3对Taq^TMDNA聚合酶的抑制常数分别为12．7μmol／L和14．4μmol／L。     

重组TgoDNA聚合酶的特性

检测了重组Tgo酶的扩增性能、 耐热性以及长距离PCR能力， 结果表明, 该重组酶扩增性能与Taq酶相当； 其耐热性极强， 在 95 ℃ 40 min， 仍具有很强的聚合活性； 利用重组酶在常规PCR条件下， 成功扩增了5.3　kb的拟南芥Timeless基因片段.     

人乳铁蛋白(hLF)cDNA的克隆及序列分析

从正常人外周血中分离中性粒白细胞（WBC）,提取总RNA,用RT—PCR的方法扩增人乳铁蛋白（hLF）cDNA．cDNA分hLF1．5、hLF0．8两段扩增并连入pMD18-T载体上,再利用限制酶连入巴氏毕赤酵母表达载体pPICZα—A中,构成完整的hLF基因．序列测定表明,所克隆的hLF基因序列全长为2,136bp,与Gene Bank中登录的序列相比,同源性达99％以上．     

应用于PCR技术的DNA聚合酶

DNA聚合酶作为聚合酶链式反应（PCR）的重要因素之一,在PCR过程中起着至关重要的作用,在某种意义上甚至可以说,PCR技术就是耐热DNA聚合酶的技术。故综合研究聚合酶并改善其酶学性能,已成为分子生物学工作者关注的热点之一。本文就PCR技术产生至今DNA聚合酶的研究历史及现状进行简要综述。     

应用于PCR技术的DNA聚合酶

DNA聚合酶作为聚合酶链式反应(PCR)的重要因素之一,在PCR过程中起着至关重要的作用,在某种意义上甚至可以说,PCR技术就是耐热DNA聚合酶的技术。故综合研究聚合酶并改善其酶学性能,已成为分子生物学工作者关注的热点之一。本文就PCR技术产生至今DNA聚合酶的研究历史及现状进行简要综述。     

人乳铁蛋白基因的克隆及序列分析与重组逆转录病毒质粒载体PLNCX2-hLF的构建

从正常人外周血中性粒白细胞中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增人乳铁蛋白（hLF）cDNA,将其克隆到pMD18-T Simple载体上并测序．用限制性内切酶Xho Ⅰ和Hind Ⅲ将目的片段与逆转录病毒载体PLNCX2进行双酶切、并用T4连接酶进行连接;然后转化到top10菌中,再次进行DNA序列测定．前后两次序列测定结果一致,没有突变,全长为2,136bp,说明所克隆的为hLF基因的cDNA序列;与GeneBank中登录的序列相比,同源性达99％以上．     

耐热DNA聚合酶介导的DNA酶促自发合成

构建了无模板引物的“类ＰＣＲ体系”。该体系在适当温度保温一段时间之后，能检测到产物出现，利用热变性分析等手段，初步研究了产物的性质，发现这些产物是随机合成的具有一些特殊构型的ＤＮＡ。本文报道三种构型，两类碱基组成比例，并通过改变反应条件观察对酶促自发合成的影响，探讨耐热ＤＮＡ聚合酶的非特异聚合活性以及介导的酶促自发合成的机理和意义。     

T7 DNA 聚合酶基因的改造及其在大肠杆菌中的表达

用聚合酶链式反应技术,从Ｔ７噬菌体中选择扩增编码Ｔ７ＤＮＡ滞酶５’→３’聚合酶的基因序列,扩增片段利用引入的酶切位点克隆至载体ＰＳＫ上,从而得到了不含有３’→５’外切酶基因的Ｔ７ＤＮＡ聚合酶基因,并将该重组基因克隆至原核表达质粒ｐＥＴ２８ａ上,在大肠杆菌中进行了表达。     

Klenow大片段聚合酶及T4DNA聚合酶在构建重组质粒中的应用

利用大肠杆菌Klenow大片段聚合酶5＇→3＇聚合酶活性和T4DNA聚合酶3＇→5＇外切酶特性构建植物高效表达载体pBLT35Svp4-ST.用pUC18-435S中的T35S启动子取代植物表达载体pBLG-VP4-ST中的双35S启动子,通过Klenow大片段的聚合酶活性对植物表达载体pBLG-VP4-ST中的HindⅢ3＇凹端补平,再利用T4DNA聚合酶外切酶活性将质粒pUC18-435S的四倍35S启动子即T35S中的SacⅠ3＇凸端削平.在T4DNA连接酶作用下将一端为平端,另一端为BamHⅠ的粘性末端的四倍35S启动子定向连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中取代原有的双35S启动子,转化并筛选阳性克隆.结果经PCR和酶切鉴定证实,四倍35S启动子成功连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中.     

非天然氨基酸修饰蛋白质研究进展

蛋白质修饰是改善其物理化学和生物学特性的一种重要方法,目前已成为生物技术、生物催化和生物医学领域的研究热点.非天然氨基酸在蛋白质修饰中表现突出.介绍了非天然氨基酸种类及修饰方法,概述了其应用领域,以期为扩大利用此方法者提供参考.     

羊毛的化学改性及其阳离子染料染色性能研究

合成了一种阴离子型羊毛改性剂,测定了羊毛纤维经改性剂处理后的白度、碱溶解度、断裂强度及伸长率等性能,讨论了改性羊毛对阳离子染料上染率的影响因素,测定了改性羊毛染色后的皂洗牢度和磨擦牢度。实验结果表明,羊毛经阴离子改性剂处理后机械性能基本不变,在100℃、pH=5、染色60 m in后阳离子染料的上染率达到80%以上,并且具有较高的染色牢度。     

铜与氨基酸配合反应的滴定量热研究

用滴定量热法分别测定了铜离子与六种氨基酸配合物在298.15 K下配位反应的热效应.计算了一级配合反应产物和二级配合反应产物的稳定常数及配位反应热焓,并由此推出反应的吉布斯自由能变化和熵变.讨论了铜离子和氨基酸的结构对配合物稳定性的影响.     

氨基酸衍生物在胶束电动色谱下的分离研究

采用新型荧光衍生试剂1,2-苯并-3,4-二氢咔唑-9-乙基氯甲酸酯（BCEOC）作为柱前衍生试剂,利用毛细管电泳在胶束电动模式下对氨基酸进行了分离,考察试剂用于氨基酸分离的几个关键条件,实现了14种氨基酸的快速基线分离.     

FAB质谱法研究肽的氨基酸序列

采用合适的底物可以使寡肽的ＦＡＢ质谱图时提供有关肽的分日子量和氨基酸的信息。发现了经验公式Ｂ＋Ｙ＝Ｍ＋２，根据这一公式可以方便地推导出肽的氨基酸序列。     

天然氨基酸中氢键的量子化学研究

用从头计算法优化了20种天然氨基酸正、负、偶极离子.计算结果表明,α-NH2上的氮原子可以和羧基氧原子形成氢键,通过N1-H2…O3氢键的生成,原子N1、H3、O4、C4、C5形成了五元环.从正离子、负离子到偶极离子,氢键强度逐渐减小.侧链原子对氢键也有影响:正离子的侧链除苏氨酸和丝氨酸外,其它氨基酸不对氢键构成影响;负离子氢键受侧链的影响较大;而偶极离子中氢键基本不受侧链的影响.     

以二元酸为扩链剂进行的聚醚改性研究

以己二酸和癸二酸做扩链剂对 DA系列聚醚进行了扩链改性 .通过对反应程度的测定 ,获得了扩链产物的相对分子质量 ,并用渤海油田稠油对其破乳性能进行了评价 .研究表明 :随着扩链反应时间的增加 ,产物相对分子质量随之增大 ,但是破乳效果随反应时间的增加呈先增大后减少的趋势 .以 DA- 1 0与己二酸进行扩链的产物破乳效果最佳者的相对分子质量为 1万左右 .研究还发现 ,以癸二酸为扩链剂的改性产物其破乳效果总体上比用己二酸改性的要好 .     

烟草制丝过程中游离氨基酸的变化研究

超声波水解提取烟叶中的游离氨基酸、AccQ-2A氨基酸衍生化试剂衍生化、反相高效液相色谱法测定卷烟制丝过程中松片回潮、润叶加料、烘丝三个工序前后烟丝中的游离氨基酸.结果表明:制丝加工制丝过程中A、B两个不同牌号的16种游离氨基酸总量增加,幅度分别达31.5%和22.1%.