低温胁迫对高山离子芥试管苗渗透调节物质及保护酶系的影响

本研究以高山离子芥试管苗为材料,研究了渗透调节物质和保护酶系对其低温胁迫的响应机制.结果表明:渗透调节物质脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白分别以各自不同的响应方式在冷冻胁迫下增强高山离子芥的抗寒性.保护酶系中,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)在减轻低温胁迫下高山离子芥试管苗膜脂过氧化伤害作用中协同互补作用;过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化酶(APX)在低温胁迫下高山离子芥试管苗清除过氧化氢机制中发挥主要作用,且CAT对低温胁迫的响应强度远高于APX,说明保护酶系在抵制低温胁迫和保护高山离子芥免受低温伤害方面具有重要的生物学功能.     

低温胁迫下油菜素内酯对高山离子芥悬浮细胞膜系统的影响

为研究低温胁迫下油菜素内酯(brassinosteroids, BRs)对植物细胞膜系统的影响,使用24-表油菜素内酯(24-epibrassinolide, EBR)在4℃处理高山离子芥(Chorispora bungeana)悬浮细胞.结果显示,低温胁迫下高山离子芥悬浮细胞的离子渗漏率和丙二醛(MDA)含量明显升高,而EBR处理显著降低了细胞的离子渗漏率和MDA含量.此外,低温胁迫下,EBR处理在一定程度上提高了膜脂脂肪酸不饱和程度并明显增强了细胞质膜H~+-ATPase,K~+-ATPase,Ca~(2+)-ATPase以及Mg~(2+)-ATPase的活性.另外,低温诱导CbCOR15基因大量表达.而在低温胁迫初期,EBR处理细胞的CbCOR15基因表达水平更高.以上实验结果表明,EBR在稳定低温胁迫下高山离子芥悬浮细胞膜系统的结构与功能方面发挥积极作用,从而保证细胞生理代谢的正常进行,以提高其抗寒能力.     

低温胁迫下高山离子芥消减文库的构建

以0?C 低温处理12 h 的高山离子芥幼苗cDNA 为检测子,以正常生长温度下的高山离子芥幼苗cDNA为驱动子,应用抑制性消减杂交技术,构建冰缘植物高山离子芥的消减文库,筛选在低温下高表达的基因片段.随机挑取96个阳性克隆进行测序分析,得到39个独立的基因片段,26个和已知基因有较高的同源性,13个为未知基因.基因分析表明:高山离子芥在低温胁迫下,微丝交联蛋白Actin cross linking protein很可能在感受低温的过程中行使作用,而DREB2A和ABF1协同作用一起调节下游冷响应基因的表达,为进一步研究高山离子芥的抗冻机制奠定了基础.     

低温胁迫对高山离子芥试管苗膜脂过氧化及AsA-GSH循环系统的影响

通过研究高山离子芥细胞在不同低温胁迫中活性氧代谢及AsA-GSH循环中生理指标的动态变化,揭示其响应低温胁迫的部分生理机制.以天然抗寒性植物高山离子芥试管苗为材料,研究了脂质过氧化产物,活性氧和抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环系统对其冷冻低温胁迫(4℃、0℃和-4℃)的反应.结果显示低温胁迫下,高山离子芥细胞中相对电导率、丙二醛(MDA)、H2O2含量和GSH不同程度的提高;抗坏血酸过氧化酶(APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)及谷胱甘肽还原酶(GR)活性在4℃和0℃胁迫下呈波动性变化,在-4℃胁迫下,APX和MDHAR活性处于抑制状态,显著低于对照(P0.05),而GR活性则呈现出先升高后降低的变化趋势.结果表明低温胁迫下,高山离子芥试管苗发生不同程度的膜脂过氧化,并可能通过增加细胞内H2O2含量来促进其抗氧化保护能力;同时AsA-GSH循环代谢中抗氧化酶(APX,MDHAR,GR)与抗氧化剂(GSH)共同协调作用,以减轻低温所造成的伤害.     

甘氨酸对不同胁迫条件下高山离子芥试管苗的保护作用

以高山离子芥试管苗为试验材料,测定冷胁迫、盐胁迫和干旱胁迫下,植株相对电导率、丙二醛浓度、脯氨酸质量分数、可溶性糖质量分数、过氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、磷脂酶D基因相对表达量和膜结合态磷脂酶D活性等生理指标,探究甘氨酸对不同胁迫条件下高山离子芥的保护作用.结果显示:甘氨酸对冷胁迫和干旱胁迫对植物造成的伤害均有一定的保护作用,对盐胁迫对植物造成的伤害则未见明显保护作用.     

新疆小拟南芥烯醛双键还原酶基因对转基因烟草耐盐性的影响

为了研究前期从新疆小拟南芥中克隆的编码烯醛双键还原酶(alkenal reductase)Ap AER基因的功能,本研究构建了带有花椰菜花叶病毒(Ca MV)的35S启动子的植物过表达载体35S:Ap AER,并转化至农杆菌GV3101中,采用叶盘法转化烟草获得了转35S:Ap AER基因的烟草。用250 mmol/L的Na Cl溶液分别胁迫转基因和野生型烟草2和4 d,并测定了脯氨酸(Proline)和丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶(CAT)及过量化物酶(POD)酶活力等生理指标。结果表明:高盐胁迫下14 d,转基因烟草的长势明显优于野生型烟草,转基因烟草普遍植株较高、叶片大、叶色深;转基因烟草的Proline含量、CAT及POD酶活力均高于对照,而反映质膜受损情况的MDA含量显著低于对照。表明过表达Ap AER基因,能提高转基因植株清除醛自由基的能力、提高脯氨酸等渗透调节物质的含量及相关还原酶活性,从而显著提高转基因烟草的耐盐性。     

马铃薯乙醇酸氧化酶StGLO1对模拟水分胁迫的响应

为了解乙醇酸氧化酶在调控植物生长代谢及生物与非生物胁迫过程中发挥的作用。本研究以‘青薯9号’马铃薯为材料克隆乙醇酸氧化酶基因StGLO1,构建过表达载体并转化烟草,观察在干旱胁迫处理下转基因烟草和野生型烟草的长势,并测定了叶片中的游离脯氨酸、CAT、POD的含量以及转基因根茎叶中StGLO1基因的表达量变化,验证过表达StGLO1烟草在干旱胁迫下的响应。结果表明:StGLO1(GenBank登录号XM_006348318.2)基因CDS为1 116 bp,编码371个氨基酸;干旱胁迫下,转StGLO1基因烟草的生长优于野生型,转基因烟草StGLO1基因的表达量在叶片中最高;转基因烟草中的游离脯氨酸、CAT、POD的含量高于野生型,达到差异显著水平(P0.05)。该结果为进一步研究马铃薯干旱胁迫响应机制有一定参考价值,也丰富了马铃薯抗旱育种的基因资源。     

转蔗糖: 蔗糖-1-果糖基转移酶基因提高烟草的耐旱性

蔗糖: 蔗糖-1-果糖基转移酶（sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase, 1-SST）以蔗糖为底物催化生成蔗果三糖等低聚合度的果聚糖.将从莴苣中克隆的1-SST基因重组到pCAMBIA1300-als中，构建了在CaMV 35S启动子调控下的植物表达载体，利用农杆菌介导的叶盘转化法将1-SST基因导入烟草中，PCR和Southern杂交检测表明获得了转基因植株，RT-PCR结果表明该基因在烟草中正常表达. 对T₀代转基因烟草进行的耐旱性分析结果表明，干旱胁迫6d的转基因植株丙二醛含量和电解质渗漏率显著低于未转基因对照，叶片相对含水量下降速度也明显比对照慢. 对转基因植株叶片糖分分析表明，转基因烟草植株积累果聚糖，并在干旱胁迫后含量明显增加，而未转基因对照植株不积累果聚糖. 在14%PEG溶液中未转基因烟草种子的萌发率仅为转基因烟草种子的一半；在附加200mmol/L甘露醇的培养基中未转基因烟草种子根的生长明显受到抑制，而转基因烟草根的生长发育正常. 以上研究结果表明，转1-SST基因烟草植株耐旱性的提高可能与该基因的表达有关.     

人参亲环素基因表达载体构建及其在拟南芥中的抗盐活性分析

摘 要 为研究人参亲还素基因的抗盐活性,为该基因在人参抗逆育种方面的应用提供参考,通过植物转基因技术和外施不同浓度NaCl的方法获得阳性拟南芥植株,研究了不同植株类型不同盐浓度下的种子萌发率、植株生存率、植株主根长、植株分支数等相关指标。结果表明：在盐胁迫作用下转基因拟南芥种子萌发率高于野生型拟南芥;在盐胁迫作用下转基因拟南芥植株生存率显著高于野生型拟南芥;在盐胁迫作用下转基因拟南芥植株主根长大于野生型拟南芥;在盐胁迫作用下转基因拟南芥植株分支数与野生型拟南芥植株分支数没有明显差异。可见人参亲还素基因提高了转基因拟南芥抵御高盐胁迫的能力。     

JcERF1基因RNA干扰载体的构建、转化及沉默效果研究

构建了麻疯树(Jatropha curcas)一个新的ERF类转录因子基因RNA干扰(RNAi)载体,并将之转入过表达JcERF1基因烟草体内, 得到了RNA干扰型烟草. 利用实时荧光定量PCR(QPCR)检测了JcERF1基因的表达量, 发现该基因在干扰型烟草中表达量明显降低. 通过野生型、过表达型和干扰型烟草的种子萌发实验和高盐胁迫实验发现: 与过表达型烟草相比, 干扰型烟草的抗盐能力明显降低, 且干扰型烟草的游离脯氨酸和可溶性糖含量在高盐处理后上升的幅度明显低于过表达型烟草. 以上研究结果说明JcERF1基因在干扰型烟草体内已被有效沉默, 同时说明该基因具有提高转基因烟草抗盐性的功能.     

番茄转录因子SlWRKY53的分离及生物学功能鉴定

构建番茄SlWRKY53的过量表达载体,通过农杆菌介导转入番茄（Solanum lycopersicum）品种Ailsa Craig（AC+）,获得转基因阳性植株.定量分析显示,这些转基因株系中SlWRKY53基因表达量显著高于野生型.表型分析显示,转基因植株对盐胁迫抗性强于野生型.对抗病性进行检测,转基因植株抗性稍强,但与野生型相比无明显差异.由此推测番茄SlWRKY53基因的过量表达能够一定程度增强植株抵抗盐胁迫的能力.     

高山离子芥磷脂酶Dα编码区基因序列克隆与表达载体构建

磷脂酶D(PLD)是重要的细胞磷脂代谢酶,在植物的生长及对不良环境胁迫的抵御反应中起重要作用.本试验以高山离子芥(Chorispora Bungeana)为材料,取幼叶分离mRNA,反转录合成cDNA,PCR扩增加XbaΙ和SacΙ酶切位点的高山离子芥磷脂酶Dα(PLDα)编码区序列、测序.结果表明插入片段为PLDα目的基因片段,全长约1 600bp,blast比对发现该序列与Genbank中报道的拟南芥PLDα基因相比同源率为94.6%.回收纯化PCR产物,克隆至pTG19-T载体双酶切后将目的基因片段定向克隆至pBI-121载体,构建高山离子芥PLDα基因编码区片段的表达载体pBI121-PLDα,双酶切及PCR鉴定结果显示表达载体构建成功,为下一步进行抗逆转基因作物选育奠定了基础.     

冷诱导基因的转录因子CBF1转化油菜和烟草及抗寒性鉴定

为研究冷诱导基因的转录因子CBF1(C-repeat binding factor)基因对植物抗寒的作用,利用PCR技术从拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)中扩增并克隆了该转录因子,并将其与CaMV 35S启动子融合构建成植物表达载体pBPCBF1.以农杆菌介导的叶盘法,分别转化了油菜和烟草.经PCR程序的DNA分析和Southern杂交对具有卡那霉素抗性的再生植株进行了鉴定,表明CBF1基因已整合进烟草和油菜基因组中.以电解质渗漏法分别检测了转化的油菜和烟草的抗寒性,结果显示转基因油菜的抗寒性较未转基因油菜有明显提高,转基因烟草抗寒性也有一定的提高.因此利用对转录因子的调控来提高植物的抗寒性可能有很好的应用前景.     

番茄红素ε-环化酶调节烟草抗旱性的研究

类胡萝卜素是一类重要的天然色素,在植物生长发育和抵御逆境的过程中起着重要作用.番茄红素ε-环化酶是类胡萝卜素合成的关键酶,催化番茄红素向α类胡萝卜素的转化.本文以烟草为材料,通过转基因手段分别获得了烟草Ntε-LCY基因的过量表达和基因沉默株系.表型分析结果显示:与野生型植株相比,Ntε-LCY过量表达植株的抗旱能力显著降低,而Ntε-LCY表达沉默株系的抗旱能力明显增强.生理指标测定结果显示:Ntε-LCY过量表达植株叶片的失水效率、活性氧(ROS)含量显著高于野生型植株,而Ntε-LCY沉默株系的生理指标值明显低于野生型植株.这些生理指标值的改变趋势与植株ABA含量的变化趋势相反,表明Ntε-LCY基因可能通过调控ABA含量,影响植株的失水效率和ROS累积,进而调控植物的抗旱性.     

麻疯树JcCBF3基因的克隆及其抗寒功能初探

从麻疯树中克隆到一个CBF3基因,命名为JcCBF3,ORF全长678bp,编码225个氨基酸;氨基酸序列同源性比对结果显示JcCBF3与其他物种CBF序列具有较高的同源性,与木薯和橡胶树的相似度最高,达到79%和74%.RT-qPCR结果表明低温胁迫12h后JcCBF3基因的表达量达到峰值,为对照的62倍.将JcCBF3构建到植物过表达载体pBI121上并成功转化烟草.低温处理下转基因烟草幼苗的游离脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性的增幅均大于野生型烟草,并且JcCBF3基因的过表达增强了含有CRT/DRE元件的下游抗性基因的表达.     

盐芥ThPHT1;8基因的克隆和功能分析

磷(P)是植物生长发育过程中重要的矿质营养元素之一,PHT1磷酸转运蛋白家族负责调控植物从土壤中吸收磷以及细胞间无机磷(Pi)的转运.本文以盐芥幼苗根cDNA为材料,克隆到盐芥磷酸转运蛋白ThPHT1;8基因.生物信息学分析结果表明,ThPHT1;8蛋白编码525个氨基酸残基,蛋白分子质量为58.1,ku,等电点6.33,是一个定位在细胞膜上的疏水、无信号肽的非分泌性蛋白,含有高亲和力磷酸转运蛋白典型的跨膜结构.实时定量PCR结果显示,低磷胁迫能促进ThPHT1;8基因在盐芥根部的表达,而且不同磷浓度处理下ThPHT1;8基因表达的模式不同.ThPHT1;8基因在转基因拟南芥中的生物学功能研究表明,不同浓度低磷胁迫处理下,与野生型拟南芥相比,35S:ThPHT1;8转基因拟南芥幼苗的主根根长显著增加、侧根密度显著降低,叶绿素含量、无机磷和总磷含量提高,花青素含量降低.上述结果表明,盐芥ThPHT1;8基因确实参与低磷胁迫时植物的应答,能够提高转基因拟南芥的耐低磷能力,为土壤磷高效利用提供了一种有潜力的候选功能基因.     

油菜BnRCH基因提高转基因拟南芥的耐盐性研究

为探索本实验室从甘蓝型油菜中克隆到的BnRCH基因在植物耐盐中的作用,比较了NaCl胁迫下转基因与野生型拟南芥在萌发及幼苗生长的差异.结果表明:在100 mMNaCl处理下,BnRCH转基因拟南芥种子萌发率比野生型高3～5倍;盐胁迫后野生型拟南芥幼苗首先表现出枯萎、白化现象;除去盐胁迫后,转基因拟南芥幼苗恢复生长状况明显优于野生型.本实验结果表明BnRCH基因能够提高转基因拟南芥的耐盐性.     

基于过表达技术的烟草NtGGPPS1基因功能的研究

将NtGGPPS1-T质粒和spCAMBIA1300载体分别双酶切(SalⅠ和KpnⅠ)后连接,转化,挑取单克隆,筛选得到植物超量表达载体spCAMBIA1300-NtGGPPS1,并通过农杆菌介导侵染栽培烟草K326,在获得阳性转基因烟草后,进行定量RT-PCR以定量分析烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1在转基因植株中的转录积累.同时,通过LC-MS和GC-MS检测转基因植株中质体色素和萜类化合物含量的变化.结果显示,与对照组相比,NtGGPPS1基因在编号为Nt1-OE1、2、3、4、7植株中表达上调,阳性转基因烟草中新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素6种质体色素,以及烟叶中代表性二萜类物质α-西柏三烯二醇(α-CBD)和β-西柏三烯二醇(β-CBD)的含量明显增加.以上结果表明,NtGGPPS1基因参与了烟草中质体色素和二萜类化合物的生物合成.     

低温胁迫对不同抗寒品种山茶花生理生化指标的影响

为了探索不同品种山茶花茶梅（Camelliasasanqua）、金花茶（Camellianitidissima）、七星球（Camelliaiaponica‘Sevenstar’）的抗寒性,采用人工模拟低温的方法对3年生的3个山茶花品种进行低温处理,系统测定叶片中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、游离脯氨酸、可溶性蛋白以及叶绿素含量指标的变化,分析各指标与抗寒能力的关系．结果表明：SOD活性在其低温耐受范围内,SOD活性升高的越快,抗寒性越强;抗寒性强的茶梅、七星球的MDA含量变化幅度较小,抗性弱的金花茶MDA含量变化幅度大;叶片中游离脯氨酸含量随低温胁迫程度的加深而升高,升高越剧烈抗寒性越弱;根据-5℃和-10oC可溶性蛋白含量变化可判断抗寒性强弱,正值较强负值较弱;叶绿素含量在0cc低温胁迫下含量随胁迫时间的延长而上升,抗寒性强的在-5℃、-10℃低温胁迫下呈上升一下降趋势,而抗性弱的随低温胁迫程度的加深含量下降．各指标在低温逆境胁迫下相互协调,共同发生作用．     

转PSAG12-ipt基因结缕草的获得及其衰老特性分析

将拟南芥中衰老特异启动子PSAG12控制下的ipt基因导入结缕草胚性愈伤组织,经抗性筛选、PCR扩增和Southern杂交,共获得37株转ipt基因植株.其中有6个转基因株系衰老延缓,绿色期延长,生育后期其体内细胞分裂素、可溶性糖、可溶性蛋白等含量明显高于野生型,而脱落酸的含量明显下降.通过测定离体叶片培养过程中光合速率的变化,也证实了转基因植株叶片衰老速度明显减慢.其中T-1和T-12两个转基因株系能延长绿色期达25 d以上.