桑葚转录组SNP/Indel位点的挖掘及功能注释

单核苷酸多态性(SNP)/插入缺失(Indel)作为基因组中最丰富的变异位点,已成为农作物中最重要的辅助育种标记。桑葚是一种营养价值较高的水果,目前果桑品种选育方法仍然以传统育种方法为主,缺乏足够的SNP/Indel标记。本研究对3个时期"安葚"果实进行转录组测序,鉴定并分析桑葚转录组序列中SNP/Indel位点的特征,将含有SNP/Indel位点的Unigene通过GO、KOG/COG、KEGG数据库进行比对。结果表明:转换类型为SNP的主要类型。绿果期与黑果期转换类型中以A/G型最多,颠换类型中以A/T型最多。红果期转换类型以C/T型最多,颠换类型中以A/T型最多。Indel片段的长度以1、2、3 bp为主,大于10 bp的缺失突变数量远大于插入突变数量。分别有28 345、6 299、5 737条序列的功能在GO、KOG/COG、KEGG数据库得到注释。从KEGG注释结果中筛选出122个与花青素、黄酮类合成相关且含有SNP/Indel标记的基因。果桑SNP/Indel标记数据库将在品种的选育、鉴定方面展现良好的应用前景。     

迟缓爱德华氏菌刺激对牙鲆转录组差异基因表达的影响

为了研究迟缓爱德华氏菌刺激下牙鲆基因表达作出的响应,采用高通量测序平台(Illumina HiSeq)分别对迟缓爱德华氏菌刺激的牙鲆和未受刺激牙鲆的肾脏进行转录组测序,并对差异基因进行生物信息学分析,包括GO(基因功能注释)、SNP(单核苷酸多态性)分析、SSR(简单重复序列)分析等.结果表明,用Trinity软件对clean reads进行拼接后,聚类得到222 980条转录本,总长200 234 420 bp,平均长度898 bp,N50为1 886 bp.对组装的序列进行基因功能注释后,有99 808条序列得到了注释.筛选出2 502个差异表达比较显著的基因,表达量上调的有1 280个,下调的有1 222个.GOseq结果显示差异基因显著富集在38个GO terms上,包括6个细胞组分、12个生物学过程和20个分子功能.差异基因共获得277个KEGG通路富集,627个差异基因显著富集到20条信号通路上,其中,8个与信号通路有关,3个与发育有关,9个与相关疾病有关.     

基于高通量测序的花斑裸鲤转录组及功能分析

为了获得花斑裸鲤丰富的转录组信息和功能基因,应用Illumina Hi SeqTM2500高通量测序技术对花斑裸鲤肝胰脏、肌肉、脑、和肾混合组织转录组进行测序,获得162 235条转录本,进一步拼接得到110 231条单基因序列(unigene),平均长度745 bp。利用生物信息学方法对所有unigenes与美国国立生物技术信息中心(NCBI)的非冗余蛋白质数据库(Nr)进行相似搜索(E-value≤10-5),结果共有34 532个unigenes(31.32%)与数据库中的已知基因同源。此外,GO功能注释将unigene分为生物过程、细胞组分和分子功能3大类56分支,依据KOG功能注释可分为26个功能组分,依据KEGG代谢通路分析可以分成5大类267小类。通过转录组测序数据及功能注释,进一步了解了更多花斑裸鲤的生物学特性、基因的分子功能、参与的生物过程、所处的代谢途径和信号通路。同时,获得了79条与天然免疫相关的同源序列。     

基于转录组的曼氏无针乌贼SSR与SNP位点信息分析

利用IlluminaHiseq平台对曼氏无针乌贼进行了转录组测序,采用生物信息学方法分析了转录组序列中的SSR、SNP位点信息并设计了SSR引物。利用MISA工具筛选了转录组测序获得的127 575条Unigene序列,共得到分布于50 626条序列中的SSR位点108 685个,SSR发生率39.68%,出现频率为85.19%。平均每949 bp含有1个SSR位点。在50626条含有SSR位点的Unigene序列中,有25 548条Unigene包含SSR位点数目在2个及以上。其中单碱基重复是EST微卫星序列的主要形式(42.84%),其次是二碱基重复(28.73%),三碱基重复(14.93%)和四碱基重复(12.79%)。在所有微卫星序列所包含的重复单元中,优势重复基元类型为A/T(占总SSRs的42.23%),其次为AT/AT (13.33%),AC/GT (9.32%),AAAG/CTTT(10.00%)。运用Primer premier 5软件共设计了46 520对SSR引物。在12 323条Unigene中发掘出SNP位点64 732个,每条Unigene平均含5.25个SNP位点。其中转换(Transition) 45 975个(71.02%),颠换(Transversion) 18 757个(28.98%)。本研究通过第二代高通量测序技术,结合生物信息学方法对曼氏无针乌贼进行了SSR位点与SNP位点的开发,为其遗传多样性分析、分子辅助育种和增殖放流效果评估等提供了有力研究工具。     

绵羊骨骼肌转录组高通量测序从头组装和特征分析

本实验旨在对绵羊肌肉转录组进行组装分析,以丰富绵羊的基因组并为进一步对绵羊的相关基因的分子遗传学研究奠定基础。选取Illumina Hiseq 2000测序平台对杜泊羊和小尾寒羊的骨骼肌转录组文库进行了高通量测序,并对测序数据进行从头组装分析。结果表明:两个测序文库共得到103058824个长为2×90bp的高质量的测序序列,经从头组装共产生了145524个unigenes。两个文库间有5718个unigenes差异表达,经GO注释分析后发现它们主要分布在细胞、细胞过程和结合条目中。将两个文库的unigenes进一步组装得到70348个平均长为863bp的all-unigenes,其中35201个被注释到Nr数据库,12219个被注释到COG数据库,并与KEGG数据库中的258个功能通路中的蛋白质和氨基酸新陈代谢通路密切相关。     

松茸子实体转录组测序及解析

以人工种植的商品松茸子实体为对象,利用Illumina Novaseq 6000测序平台对松茸子实体进行转录组测序,并通过生物信息学手段对松茸转录组进行注释和分析.基于9个松茸样品的测序共获得76.38 Gb的数据量,组装得到的转录本和unigene个数分别为26 285和87 174.将获得的unigene与6大功能数据库进行比对,共有19 964个unigene得到注释.基于GO和KEGG数据库的注释和分析,松茸子实体unigene被注释和划分为45个和28个功能类别.在松茸子实体中,涉及unigene数量最多的生理过程包括碳水化合物代谢、运输和分解代谢、氨基酸代谢等.结果表明,松茸子实体中代谢旺盛,应采取合理措施以延缓其品质下降.松茸子实体的转录组测序将为其功能基因的挖掘以及采后品质变化机制的研究提供重要遗传数据和参考.     

青钱柳叶片转录组数据组装及基因功能注释

青钱柳是一种民间常用中药,青钱柳叶中有多种生物活性的次生代谢物,如有机酸、黄酮类、皂苷类、铱类、精油、无机元素等,但对于青钱柳次生代谢产物合成的分子机制仍未见有报道.使用Illumina公司Hiseq 4000平台对青钱柳叶进行转录组测序,对 reads 进行拼接,得到50 126个unigenes平均长度为 1 247 bp,有19 875 (39.65%) unigenes由NCBI非冗余数据库进行注释的,23 716 (47.31%) unigenes被注释到GO数据库,14 950个(29.82%) unigenes匹配到COG 功能组.进一步的分析结果显示,6 012 (11.20%)个 unigenes被富集到 254个 KEGG 代谢通路,其中1 212个unigenes参与了次生代谢产物的生物合成,并且发现126个unigenes参与异戊二烯代谢,包括萜烯类、香茅醛、呋喃酮、苷的代谢途径.此外,总共检测到21 089个简单序列重复(SSRs).通过对老叶与嫩叶的转录组比较分析结果显示,在青钱柳不同生长发育时期的叶片中,基因表达上调占主异作用的过程主要涉及萜类和多肽的代谢、辅酶和维生素的代谢和氨基酸代谢,而基因表达下调占主异作用的过程主要涉及信号传输、类脂物代谢与能量代谢.该转录组数据可为青钱柳重要生物活性成分的生物合成和调控提供参考.     

根瘤菌87-1-1诱导刺槐根表皮传递细胞特异性表达的cDNA文库构建及序列分析

探寻根瘤菌诱导刺槐后根表皮细胞分化成传递细胞的特异性表达基因及其分子机制.采用抑制差减杂交(suppression subtraction hybridization,SSH)技术构建刺槐根系被接种根瘤菌和未被接种根瘤菌二者间的正反两个c DNA文库.各挑选正反文库中500个克隆进行测序,在Blastn、Blastp、Swiss Prot、KEGG、COG、Interpro以及Gene ontology(GO)数据库中进行比对注释.结合生理过程对ESTs进行分析,共获得725条非冗余序列(uni EST),正反向文库分别为385条和340条,其中包括674个单一序列(singlets),51个拼接序列(contigs).在Nt库比对中有674条uni ESTs与已知基因匹配,占比93%;在Nr库比对中有648条序列有匹配蛋白,占比89%.有正向文库213个uni ESTs和反向文库156个uni ESTs能进行Geney ontology(GO)功能注释,在细胞组分被注释了270次,分子功能被注释了448次,生物过程被注释了484次.uni ESTs的功能分析显示,正向文库中多与细胞翻译后修饰、转录因子、细胞信号通路、细胞壁/细胞膜/内膜系统以及细胞骨架相关蛋白有关,部分是结瘤相关基因.而反向文库中与细胞生长、代谢物形成的基因相关较多,这与根瘤菌处理刺槐后的生理过程一致.在根瘤菌诱导的刺槐根组织文库中发现特异性基因如MYB类转录因子、囊泡相关膜蛋白等与传递细胞相关的基因,结果有助于进一步研究此类传递细胞的形成分化机制.     

灰树花菌（Griflola frondosa）子实体原基转录组测序及分析

采用Illumina测序平台对灰树花菌（Griflola frondosa）原基进行转录组测序,获得了大量转录组信息.结显示果,测序得到38 189个非冗余Unigene,在Nr数据库中有31 454个Unigene被注释;与KEGG数据库比对,共有1 832个Unigene被注释,分属20条生物通路;在COG数据库中注释可划分为25类;与GO数据库进行注释可分为分子功能、细胞组分和生物过程3个主类和60个二级亚类.     

鹿茸草全长转录组测序与次生代谢产物生物合成相关基因的挖掘

为获得鹿茸草的全长转录组信息,挖掘鹿茸草次生代谢化合物生物合成途径相关酶的基因,该文基于单分子测序技术,利用Pacbio高通量测序平台,对鹿茸草进行全长转录组测序,共获得48 005条去冗余的高质量转录本,与NR、Swiss-Prot、GO、KEGG等8个数据库进行BLAST比对,共有45 362个转录本被成功注释,注释率为94.50%.其中有389条转录本被注释到KEGG的10条标准次生代谢生物合成通路中.对转录组数据进一步分析发现：参与鹿茸草苯丙素类生物合成的转录本有194条,参与生物碱类生物合成的转录本有115条,参与类黄酮化合物生物合成的转录本有23条,参与其他次生代谢产物的转录本有57条,参与次生代谢后氧化与糖基化修饰的转录本有204条.鹿茸草全长转录组的获得极大地丰富了鹿茸草的遗传信息,初步揭示了参与鹿茸草次生代谢产物合成相关的基因通路,为深入研究鹿茸草次生代谢产物合成途径关键酶的功能及其调控机制奠定了基础.     

短丝木犀转录组测序及类胡萝卜素生物合成相关基因表达分析

短丝木犀(Osmanthus serrulatus)是我国特有的木犀属香花树种,具有极高的开发应用前景。笔者以短丝木犀为研究材料,应用Illumina HISeq^TM2000高通量测序平台,对短丝木犀的花和叶芽进行转录组深度测序和拼接组装,构建和预测了短丝木犀不同组织间的基因表达谱及其代谢通路。转录组测序共获得16.94 G的有效数据,经Trinity从头组装得到 92 798条单基因簇(unigenes),其中35 851条unigenes与Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG、PFAM等7大公共数据库比对获得了基因功能注释信息。由KEGG 代谢通路分析发现,共有8 779条unigenes参与到262个代谢通路中,其中参与到色素和香味代谢的基因分别有53条和335条。此外,针对6条在短丝木犀花和叶芽间显著差异表达的参与类胡萝卜素生物合成的相关基因,通过实时荧光定量PCR,验证了它们在不同组织间的表达模式。     

两株小鼠诺如病毒的分离与鉴定

摘要: 目的了解江苏地区常用实验小鼠诺如病毒( murine norovirus,MNV) 的感染情况及进化特征。方法在江苏地区抽取三个实验动物中心的实验小鼠,采集直肠及内容物样本,应用ＲT-PCＲ 方法检测MNV OＲF2 特异性基因( 547bp,MNV nt5104-5650) 。阳性样本经ＲAW264. 7 细胞分离病毒,对MNV 分离株的VP1 基因进行扩增,将其连接在pEASY-Blunt 载体上,转化至大肠杆菌Trans1-T1 感受态细胞,通过Kanamycin 抗性筛选,挑取菌落进行PCＲ鉴定,鉴定为阳性的克隆送检测定其VP1 基因序列,构建系统发生进化树。结果共检测小鼠直肠内容物30 份,检出MNV 阳性样本4 份,包括ICＲ 小鼠( 2 /8) 、BALB/c 小鼠( 1 /12) 和C57BL/6J 小鼠( 1 /10) ,感染率为13. 3%;ＲAW264. 7 细胞接毒盲传三代,两只ICＲ 小鼠样品接种的细胞产生明显细胞病变( CPE) ,表现为细胞圆缩聚集,大部分脱落死亡,而C57BL/6J 和BALB/c 小鼠样本接种ＲAW264. 7 细胞无CPE; 应用VP1 特异引物经ＲT-PCＲ 检测,表现CPE 的细胞样本出现特异条带,测序结果显示分离到的2 株MNVVP1 核酸序列均为1626bp,与引物设计参考毒株S7-P2( GenBank 登录号: AB435514) VP1 基因大小相同,进化树图表显示检测到的2 株MNV 属同一独立小分支与参考株BJ10-2062、CＲ4 最为相近。结论此次抽检的实验小鼠MNV 感染率为13. 3% ( 4 /30) ,考虑可能在同一设施内传播。常用实验小鼠携带病毒的生物学意义有待进一步研究。     

小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCＲ 方法的建立

摘要: 目的为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCＲ 检测方法。方法根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox 基因、假结核耶尔森氏菌inv 基因、志贺氏菌ipaH 基因及空肠弯曲菌gyrA 基因设计并筛选出特异性引物; 优化退火温度等条件,分析多重PCＲ 的特异性、敏感性,使用该多重PCＲ 方法检测小鼠和豚鼠样品。结果多重PCＲ 扩增出了预计的PCＲ产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌( 511 bp) 、假结核耶尔森氏菌( 779 bp) 、志贺氏菌( 290 bp) 和空肠弯曲菌( 156 bp) 。该方法的灵敏度为1 × 10 － 3 ng /μL( 小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌) 和1 × 10 － 2 ng /μL( 空肠弯曲菌) 。特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带。使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数。结论该多重PCＲ 方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景。     

矢竹地下茎转录组测序及节间生长相关基因表达分析

【目的】揭示竹子地下茎生长发育的分子机制。【方法】利用高通量转录组测序对矢竹含不同发育阶段节的地下茎转录组图谱进行了分析研究,并利用qRT-PCR对节间生长相关基因进行表达模式分析。【结果】共获得了11 976 条平均长度为1 008 bp的单基因簇(unigenes)。NCBI注释显示,63.8%的单基因簇具有注释结果,其中16 254 条unigenes被注释到137 个KEGG(京都基因与基因组百科全书)代谢通路中。MapMan分析共获得了1 864 个转录因子及603 个激素代谢及信号转导相关单基因簇。在功能基因方面,共获得564 个与细胞壁构建相关的代谢基因,其中92 个与木质素合成相关。此外,对9 个与赤霉素、细胞壁合成及细胞骨架组织相关的基因,通过实时荧光定量PCR,分析了它们在节间不同发育阶段的表达模式。结果显示:细胞壁、细胞骨架下游功能相关基因在矢竹地下茎节间快速生长阶段表达最高; 而赤霉素合成及信号传导相关基因则在节间伸长起始阶段最高。【结论】矢竹地下茎生长发育受到从各类激素、转录因子到其下游功能基因等组成的复杂分子网络的协同调控。     

2013 ～ 2015 年实验动物质量检测机构实验室能力验证结果分析

摘要: 目的通过整理2013 ～ 2015 年实验动物质量检测机构能力验证活动的结果,发现实验室存在的问题,促进实验室检测水平的提升。方法按照ISO/IEC17043 实施能力验证,统计定性实验的结果,对实验室的能力进行评价。结果全国各实验室累计174 次参加了2013 ～ 2015 年的9 个能力验证项目,提交了171 个结果,其中满意结果为151 个,整体满意率为88. 3%。9 个项目的满意率分别为94. 1%、80. 0%、88. 9%、85. 0%、78. 6%、90. 0%、100. 0%、93. 3%和80. 0%。结论通过参加2013 ～ 2015 年的能力验证活动,实验室提升了实验动物质量检测能力,加强了实验动物质量评价体系的建设。     

树鼩角膜内皮细胞体外原代培养方法的建立

摘要: 目的 建立树鼩角膜内皮细胞( corneal endothelial cells,CECs) 体外分离、培养及纯化的稳定技术,为人类眼科角膜疾病提供新的实验材料。方法 通过比较揭膜法、双酶消化法及揭膜-消化两步法,确定每种树鼩原代 CECs 取材方法的优劣性。分别使用 DMEM /F12,M199,Ham’s F12 /M199 三种培养液以确定树鼩 CECs 原代细胞最适培养液。使用 TGF-β 抑制剂、低血清培养法及梯度消化法来探讨树鼩 CECs 纯化的可行性。苏木精-伊红染色观察细胞形态,根据树鼩神经元烯醇化酶( NES) 设计并筛选特异性引物,使用 PCＲ 方法检测细胞 NES 表达情况并用 NES 抗体进行细胞免疫荧光染色鉴定。结果 揭膜法可以快速、有效得到高纯度的树鼩 CECs 细胞。Ham’s F12 /M199 培养液是树鼩 CECs 的最适培养液。使用 TGF-β 抑制剂可以达到 CECs 的纯化目的。结论 优化的树鼩 CECs 细胞培养纯化方法对树鼩 CECs 的体外培养更适宜,优化条件下分离培养的细胞符合 CECs 的一般特征。     

DAP 玻璃化冷冻液对小鼠2-细胞胚胎的冷冻保存

摘要: 目的探索和优化小鼠2-细胞胚胎冷冻效果,建立小鼠胚胎冷冻保存技术以及超低温保存模型动物胚胎实验室所需的相关技术。方法选择3 个品系( C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － ) SPF 级4 周龄雌性小鼠,运用超数排卵、体外受精、玻璃化冷冻法,以及二细胞期胚胎复苏、体外培养等技术方法,观察上述实验效果。结果C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － 3 个品系小鼠超数排卵平均值分别为42. 98 个/只、27. 93 个/只、23. 11 个/只,体外受精2-细胞期胚胎率分别为68. 79%、32. 70%、23. 08 %,胚胎冷冻复苏后胚胎回收率72. 77%、80. 87%、83. 33%,存活率分别为56. 92%、54. 84%、70%,存活胚胎体外培养发育到囊胚比率分别为72. 37%、60. 78%、25%。结论选择4 周龄小鼠,按预定相同的技术方法做超数排卵、体外受精、胚胎冻存、胚胎复苏,呈现出较好效果,C57BL/6 小鼠优于基因工程小鼠,基本建立起小鼠2-细胞胚胎冷冻保存技术。     

以斑马鱼模型评价6 种药物的神经毒性

摘要: 目的以斑马鱼为模式生物,评价6 种已知对人类具有神经毒药物吗替麦考酚酯、异烟肼、环孢素A、卡马西平、苯妥英钠和乙醇对斑马鱼的神经毒性。方法挑选受精后5 d( 5 dpf) 的野生型AB 系斑马鱼在含吗替麦考酚酯( 4. 5、15、45 和51 μmol /L) 、异烟肼( 1 460、4 866、14 599 和15 328 μmol /L) 、卡马西平( 17. 5、58. 3、175 和187μmol /L) 、苯妥英钠( 16. 7、55. 7、167 和185 μmol /L) 、乙醇( 0. 18%、0. 63%、1. 81% 和2. 0%) 、环孢素A( 5、16. 7 和50 μmol /L) 的养鱼用水中暴露,实验过程中不做换液处理, 24 h 后,利用斑马鱼行为分析仪检测斑马鱼的总运动距离,评价6 种药物对斑马鱼运动活力的影响; 受精后1 d( 1 dpf) 的运动神经元转基因斑马鱼胚胎在含吗替麦考酚酯( 0. 15、0. 5、1. 5 和5. 5 μmol /L) 、异烟肼( 10 971、36 596、109 708 和111 825 μmol /L) 、卡马西平( 45. 9、153、459 和 484 μmol /L) 、苯妥英钠( 200、667 和2000 μmol /L) 、乙醇( 0. 19%、0. 62%、1. 86% 和1. 98%) 、环孢素A( 5、16. 7 和 50 μmol /L) 的养鱼用水中暴露,实验过程中不做换液处理, 48 h 后,在荧光显微镜下拍照,分析统计斑马鱼次级运动神经元轴突的长度,评价6 种药物对斑马鱼运动神经元轴突生长的影响。结果吗替麦考酚酯、乙醇、卡马西平暴露后,随着浓度增加,斑马鱼运动距离先增加后减少,产生典型剂量依赖性倒“U”型运动; 异烟肼和苯妥英钠暴露后,随着浓度增加,对斑马鱼运动活力抑制作用逐渐增强; 环孢素A 暴露后,随着浓度增加,斑马鱼产生兴奋性,斑马鱼总运动距离逐渐增加; 6 种药物作用后,斑马鱼运动神经元轴突长度均变短,表明6 种药物在实验剂量下均能抑制运动神经元轴突的生长。结论斑马鱼模型可用于初步评价药物神经毒性。     

低频电刺激对脏器中激素含量的影响

摘要: 目的探索低频电刺激对中国树鼩死亡后脏器中激素水平的影响。方法给予中国树鼩低频电刺激,分别于死亡后0 h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h、36 h 和72 h 取甲状腺、肝脏、脾脏,用放射免疫法测定内皮素( endothelin,ET) 、心钠素( atrial natriuretic factor,ANF) 、血栓素( thromboxane,TX) 水平; 剥取死后0 h 中国树鼩中脑腹侧背盖区( ventral tegmental area,VTA) 检测c-fos 表达。结果电刺激后,中国树鼩尸体脏器中内皮素、心钠素、血栓素水平比对照组显著升高,其含量随死亡后时间的延长而降低,且呈现一定的趋势; VTA c-fos 表达明显增强。结论低频电刺激能引起中国树鼩脏器中激素的合成、释放和脑组织c-fos 表达。