“通脉口服液”延缓肾小管间质纤维化研究

在前期实验结果表明益气活血中药复方"通脉口服液"对UUO致肾小管间质纤维化模型大鼠良好药效的前提下,探讨其疗效机制.通过免疫组化法检测肾组织内colIV、MMP-9、TIMP-1的蛋白表达,原位分子杂交方法检测肾组织结缔组织生长因子CTGFmRNA的表达,E lisa法检测肾组织及血清t-PA、PAI的含量.结果显示,"通脉口服液"可明显下调colIV的表达;"通脉口服液"可明显上调MMP-9并下调TIMP-1的表达;"通脉口服液"可明显降低CTGFmRNA的表达;"通脉口服液"可明显升高肾组织内t-PA,降低肾组织PAI的含量,但对血清内t-PA、PAI含量无影响.     

rPA(K)的定点突变及其真核表达载体在COS-7细胞中的瞬时表达

采用定点突变技术,对真核表达载体pCSRK上的目的片段rPA(K)进行突变,获得了含有突变体rPA(KN)(N184→Q)的真核表达载体pCSRKN.酶切和测序结果证明,成功去除了184位的糖基化位点.用LipofectamineTM2000 Reagent将pCSRKN转染至COS-7细胞,取转染后不同培养时间上清,以FAPA法进行检测.结果表明,表达产物具有良好的溶圈活性,从而验证了pCSRKN在真核系统表达的可行性.     

鸡胚细胞的培养

研究了鸡胚细胞的生长规律，葡萄糖的利用和乳酸、氨等代谢产物的积累规律，比较了培养基对细胞生长的促进作用，筛选了合适的微载体，初步探讨了用微载体培养鸡胚细胞的方法。实验结果表明，鸡胚细胞在DMEM培养基中生长良好，最适合的微载体为胶原型微载体，如GT-2，Gytodex-3。     

表达vWF蛋白的重组BHK细胞的无血清培养

采用HADAMARD统计设计方法建立了适于重组BHK细胞培养和vWF蛋白表达的无血清培养基SFMA。用SFMA进行重组BHK细胞的批培养,细胞生长明显优于有血清培养(DMEM FBS(φPRS=0．05))和无血清培养基SFM-Ⅱ的培养,最大细胞密度可分别提高16．7％和40%。同时,在培养的96h,蛋白的表达水平比有血清培养提高了18．7%,SFMA维持培养48h的vWF蛋白的表达水平比SFM-Ⅱ提高了50％。     

人食管鳞癌Eca109细胞株中肿瘤干细胞的分离与鉴定

为分离富集人食管鳞癌Eca109细胞株中肿瘤干细胞,并对其"干细胞"特性进行鉴定。采用无血清(DMEM/F12 1∶1,无血清)成球培养法获得细胞球,应用免疫荧光细胞化学技术检测Eca109细胞株中细胞球细胞中干性相关转录因子的表达;平板克隆和MTT法检测细胞体外增殖情况;Transwell小室法检测其细胞侵袭能力。结果显示,无血清培养4 d获得Eca109细胞球;P75NTR和Oct-4荧光定位于细胞球细胞的细胞核上,Eca109细胞为细胞核和细胞浆表达,但是Oct-4荧光强度比P75NTR弱;MTT法测增殖显示细胞细胞球增殖率明显高于Eca109细胞,差异有统计学意义(P0.001);平板克隆实验显示细胞球细胞形成克隆团数高于Eca109细胞;Transwell小室法结果显示细胞球细胞侵袭力高于Eca109细胞。由此可知,食管鳞癌Eca109细胞系通过无血清成球培养法获得细胞球,细胞球存在肿瘤干细胞。     

贝氏高原鳅不同组织原代培养的研究

采用胰酶半消化法,对贝氏高原鳅的吻端、肾脏和性腺组织的原代培养条件进行探究,使用MEM,RPMI1640,DMEM和DMEM/F12培养基进行培养;血清质量分数设置为10%,30%,50%和100%;分别置于37℃,26℃和室温(11～15℃)条件下培养,观察细胞在不同条件下的生长情况.初步确定了各组织原代培养的最佳条件是温度26℃、血清质量分数50%的条件下,吻端和肾脏组织在MEM培养基、精巢在DMEM培养基中生长情况最优.Giemsa染色显示各组织细胞结构完整,荧光染料Alexa fluor 488Phalloidin显示各组织细胞的微丝网络发达.     

新生大鼠大脑皮层和海马神经元体外培养方法及改进

探索用24 h内新生SD大鼠进行神经元体外培养的方法.取新生SD大鼠的大脑皮层和海马,胰酶消化5～10 min后,放入含100 g/L血清的DMEM/F12培养基中培养.24 h后,更换含B27无血清培养基.以后每隔1d,半换液.结果显示绝大部分神经元于第2天长出突起,第3天神经元间形成复杂的联系,第7天神经元发育基本成熟.经神经元特异性烯醇酶(NSE)鉴定,培养细胞均为神经元,纯度可达90%以上,可以用于实验.     

重组免疫球蛋白恒定区-肿瘤坏死因子受体II的应用研究

目的基因经pEE12.4质粒扩增,脂质体Free Style TM MAX转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO-细胞),构建出细胞株.细胞株经50μmol/L L-Methionine Sulfoximine加压筛选、培养基、添加剂等优化后,最终获得活性蛋白表达量高达58.54mg/L的细胞株,培养液纯化后,目的蛋白在SDS-PAGE为一条带,HPLC纯度为96.5%.     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据GenBank中aiiA基因设计引物,以苏云金芽孢杆菌基因组为模板扩增出aiiA基因后构建出pPIC9K-aiiA重组表达载体,线性化后转化毕赤酵母GS115,获得重组工程菌GS115/pPIC9K-aiiA,以体积分数为1%的甲醇进行诱导表达.表达产物经SDS-PAGE及Western blotting分析显示表达的蛋白具有较好的免疫特异性.抗病性实验显示表达的目的蛋白具有生物学活性和良好的抗病能力.     

rCHO细胞无血清适应及悬浮培养

考察了血清对rCHO(C28)细胞生长与产物(HBsAg)表达的影响,发现φ血清<0.01时细胞出现明显的代谢转换;考察了微量元素、氢化可的松、混合脂类与短多肽混合物(TL混合物)对细胞的影响,建立了适于rCHO(C28株)生长的无血清培养基MT-SFM;在将细胞从有血清转到无血清状态时,阶段性降血清比直接降血清更有利于rCHO(C28)细胞的无血清适应;当细胞适应了MT-SFM无血清培养基后,批培养中细胞的最大平均比生长速率可达0.65d-1,产物HBsAg的滴度在32～64之间。     

常见肝癌细胞系的转铁蛋白受体表达差异分析及主动靶向载体效率比较

转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TfR1)可介导细胞内吞过程,从而摄取与之特异结合的纳米颗粒,因此成为许多主动靶向型纳米载体的靶点。研究表明,肝癌细胞存在TfR1高表达现象,可作为肿瘤治疗纳米药物递送系统的关键性靶点。体外评价是TfR1靶向纳米载体的重要研究环节,然而肝癌细胞模型种类繁多,其TfR1表达水平可能存在一定差异。选择了几种常见的肝癌细胞系,包括HepG2、Hep3B、MHCC97-H以及Huh-1,分别从mRNA水平以及蛋白水平测定了细胞系TfR1的表达情况,考察了转铁蛋白(Tf)以及转铁蛋白核酸适配体(transferrin nucleic acid aptamer, Tf-APT)对不同细胞的亲和效率。同时,制备了包载紫杉醇的TfR1靶向脂质体,并考察其对不同细胞系的细胞生长抑制作用。结果表明,4种肝癌细胞系在mRNA水平以及蛋白水平均存在TfR1的表达差异;同时,体外抗肿瘤结果显示,不同肝癌细胞系对紫杉醇-TfR1靶向脂质体的敏感性也存在显著不同。     

Investigating the function of Akt by tet-off inducible expression system

A tet-off inducible cell line named BBT derived from BA/F3b cell line was constructed and the effect of this inducible expression system was significant when detected by tet-off responded luciferase reporter gene assay. Then tet-off responded Akt expression plasmid was transfected into BBT cells, and the stable cell lines were screened. The result of Northern blot showed that the expression of akt was significantly inducible. The clone with the best inducible effect was selected and named BBA for investigating the function of Akt. We found that Akt could significantly inhibit zinc-induced decrease of cell viability when assayed by MTT method. And the flow cytometric analysis showed that Akt could markedly repress zinc-induced apoptosis.     

条斑星鲽连续性鳍细胞系的建立与鉴定

为了建立条斑星鲽鳍细胞系,为其细胞工程及病毒学研究奠定基础,对经Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法所得鳍组织碎块分别用DMEM/F12、L-15和M199培养液(pH7.2)在18～26℃进行了鳍组织的体外培养,并在所筛选出的最适培养液和培养温度下通过添加羧甲基壳寡糖、碱性成纤维样生长因子(bFGF)和I型胰岛素样生长因子(IGF-I)启动了鳍细胞的原代培养。体外培养结果显示,条斑星鲽鳍细胞的最适培养液为DMEM/F12培养液,最适培养温度为22℃,原代培养鳍细胞的生长分裂状态旺盛,细胞形态主要为成纤维样,20d后便可形成汇合细胞单层,经过连续的继代培养已建立了条斑星鲽的连续性鳍细胞系,目前已传至第135代;生长特性检测结果显示,第60代鳍细胞系细胞的群体倍增时间为56.9h,其生长分裂状态依然十分旺盛;染色体分析结果显示,第60代鳍细胞系细胞虽然出现了染色体的非整倍性,但其特征性染色体数目仍为46条,并具有2sm+44t的正常二倍体核型,证明所建立的细胞系确为条斑星鲽连续性鳍细胞系。该细胞系为条斑星鲽的细胞工程育种和病毒-细胞相互作用提供了一个理想的体外研究体系,具有重要的理论意义和应用价值。     

疏水层析在分离纯化里氏木霉重组t-PA中的应用

疏水层析是一种有效的分离纯化手段,本文采用Octyl Sepharose和Butyl Sepharose两种疏水层析填料对里氏木霉表达的t-PA的提纯操作条件进行了初步研究。结果表明,选用Butyl Sepharose FF填料,上样量10mL（蛋白含量4．1mg／mL),用15％(NH4)2SO4的PBS以2mL／min的流速进行洗脱时,回收的酶的比活性较大,为2959．54U／mg,纯化倍数为5．16,回收率为7．12％。     

表面活性剂和促进剂对重组里氏木霉生物合成t-PA的影响

重组里氏木霉(Trichoderma reesei)是染色体上整合有组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA的基因工程菌株.对高产t-PA的重组里氏木霉菌株进行了筛选,并研究了乙酸钠和抗坏血酸(Vc)等促进剂及曲拉通(Triton100)、吐温80(Tween80)、十二烷基磺酸钠(SDS)和蔗糖酯等表面活性剂对菌株生物合成t-PA的影响.结果表明:乙酸钠能促进t-PA的生物合成,在发酵培养基中,其浓度为0.1%时,酶活可提高36.42%;吐温80对t-PA的合成有促进作用,其浓度为0.1%时,酶活可提高82.04%;抗坏血酸也可促进t-PA的合成,其浓度为0.05%时,酶活可提高124.82%;曲拉通和十二烷基磺酸钠加入时完全抑制t-PA的合成;蔗糖酯对t-PA的合成有部分抑制作用.     

The molecular mechanism of different sensitivity of breast cancer cell lines to TRAIL

Although Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) selectively induces apoptosis of various cancer cells, some caner cell lines are resistant to TRAIL-induced cell death. To investigate the molecular mechanisms underlying TRAIL-resistance, two human breast cancer cell lines, MCF-7 (resistant to TRAIL) and MDA-MB-231 (sensitive to TRAIL), were used as a model system to analyze the different sensitivities to TRAIL cytotoxicity. PKCδ inhibitor rottlerin, but not MEK and ERK1/2 inhibitor U0126 nor PI3K inhibitor LY294002, was shown to enhance TRAIL-induced apoptosis in MCF-7 cells significantly, suggesting that PKCδ might play an important role in the resistance of MCF-7 cells to TRAIL. In contrast, rottlerin, U0126, and Ly294002 had no effect on MDA-MB-231 apoptosis induced by TRAIL under the same conditions. Further experiment showed that the combination of rottlerin and TRAIL cleaved PARP in the MCF-7 cells synergistically, but not in the MDA-MB-231 cells. The role of PKCδ in TRAIL-resistant MCF-7 cells was confirmed by knocking down the endogenous PKCδ expression using RNAi technology. Furthermore, caspase-3 reconstitution in MCF-7 cells was unable to alter PKCδ expression, suggesting that innate caspase-3 deficient in the cells does not cause PKCδ high expression. These data provide evidence for the first time that PKCδ plays a critical role in breast cancer cell lines to TRAIL cytotoxicity.     

重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞株的感染效率及EGFP表达水平研究

研究重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞的感染效率及表达水平，可为痘苗病毒表达系统宿主细胞的正确选择提供依据．本研究利用重组绿色荧光蛋白基因的痘苗病毒WR—EGFP同时感染不同的哺乳动物细胞株，利用流式细胞仪检测EGFP的表达强度．共使用20种哺乳动物细胞株，其中10种人类组织细胞，2种猴组织细胞。8种小鼠组织细胞．结果表明，重组痘苗病毒wR-EGFP对鼠细胞系BHK21和人细胞系A-549的感染效率和表达效率最佳；整体看，痘苗病毒对多数灵长类动物细胞的感染效率和表达效率优于鼠细胞；对贴壁细胞的感染效率和表达效率明显优于悬浮细胞；但没有特别的组织偏嗜性。     

人类逆转录病毒的长末段重复序列（VRTVLTR）的表达与肺癌转移的关系

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。肿瘤癌很容易发生转移。实验以17例肺癌（5例肺腺癌、1例腺鳞癌、7例肺鳞癌及4例小细胞末分化癌）的原发灶、癌旁正常组织及转移淋巴结为材料,采用PCR及非放射性标记的RNA斑点杂交分析LTR在基因组的存在及其表达情况。研究结果发现：LTR序列在17例肺癌病人的正常组织及肿瘤组织的基因组中普遍存在,LTR致肺癌转移与其插入基因组中无关;LTR致肺癌转移与其表达增高有关,而且其高表达与小细胞肺癌的转移无关,而与非小细胞肺癌的转移密切相关。提示LTR参与了非小细胞肺癌的转移过程。实验结果为从细胞系获得的结论提供了进一步的证据。     

糖尿病患者血栓前状态研究

采用流式细胞仪、ELISA法、全自动血凝分析仪,检测糖尿病患者血小板表面P-选择素(CD62P)的表达、血浆组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、抑制剂(PAI-1),以及凝血4项,即血浆纤维蛋白原(Fib)水平、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)。结果显示,糖尿病组血小板表面CD62P的表达、血浆PAI-1、Fib 3项指标均较正常组增高(P<0.05),而t-PA水平较正常组降低(P<0.05);糖尿病组APTT、PT及TT时间明显缩短(P<0.05);糖尿病伴血管病变组血小板表面CD62P的表达、血浆PAI-1、Fib 3项指标均较不伴血管病变组增高(P<0.05);糖尿病伴血管病变组APTT及TT较不伴血管病变组明显缩短(P<0.05);糖尿病伴血管病变组血浆t-PA水平、PT与不伴血管病变组指标比较没有显著性差异(P>0.05)。研究表明,糖尿病及糖尿病伴血管病变患者血小板活化、凝血功能增强、纤溶功能减退,存在明显的血栓前状态;测定血小板表面CD62P的表达、血浆t-PA、PAI-1,以及凝血4项,即血浆Fib水平、APTT、PT、TT等有助于早期发现血栓前状态及血管病变,并可以指导临床早期干预治疗。