质粒DNA纯化及内毒素去除策略研究进展

质粒DNA(plasmid DNA)是最常用的基因工程和基因疫苗载体,近年来在生物医学和环境科学等领域得到了广泛应用。质粒DNA纯化是分子生物学研究中常用的实验技术,纳米磁性粒子等固相载体技术和色谱技术优化了DNA纯化方法。对大肠杆菌质粒DNA常用纯化方法、内毒素去除策略以及自动化纯化设备进行综述,为质粒DNA的应用研究提供支持。     

结核病核酸疫苗纯化过程的初步研究

对结核病核酸疫苗的质粒DNA的制备性纯化过程进行了初步研究。此工艺主要包括以简化的碱裂解法处理大肠杆菌、超滤与离心法除大部分杂质并浓缩样品、Q-Sepharose阴离子交换层析、DNA B ioSepharTMFF亲和层析等步骤,以去除细胞RNA和蛋白等杂质,并对不同分子结构的质粒DNA作分离。结果表明:以碱裂液中质粒DNA为计算基准的得率为56.61%、超螺旋质粒DNA的电泳纯度100%。     

质粒DNA计算模型的计算体系

首先从具体实例入手抽象和归纳出质粒DNA计算模型的概念,并对质粒DNA计算模型计算体系的2个基本要素———计算物质和计算手段进行研究,由此形成了质粒DNA计算模型完备的计算体系;然后针对质粒DNA计算模型计算体系的应用,分析和解决了经常出现的关键问题.讨论了初始质粒DNA重新合成的重要性,并给出了重新合成的方法;接着对计算体系的2个基本实验(酶切和酶连实验)的成功率问题进行了分析,并提出了解决的方案;最后对检测实验进行了分析,提出了检测多种DNA序列的检测方法.对这些问题的分析和解决有利于质粒DNA计算模型理论的完善和应用的拓广.     

超高压处理对大肠杆菌DH5α质粒DNA的影响

文章研究了超高压处理对大肠杆菌DH5α菌株质粒pMD-18DNA的影响.大肠杆菌DH5α在不同的压力下于25 ℃处理15 min后,提取其质粒pMD-18DNA,检测质粒在260 nm和280 nm处的吸光度得到其纯度,并进行了琼脂糖凝胶电泳.实验发现:大肠杆菌DH5α质粒pMD-18DNA经100 MPa、200 MPa处理后其A260、A280与未经高压处理样相比吸光度下降;而经300 MPa、400 MPa和500 MPa处理后其吸光度与未经高压处理样相比吸光度上升.通过琼脂糖凝胶电泳分析,大肠杆菌DH5α质粒DNA经高压(300 MPa、400 MPa和500 MPa)后条带增多.实验结果表明超高压处理影响了质粒DNA的结构.     

HCG β抗肿瘤核酸疫苗的纯化工艺

对HCGβ抗肿瘤核酸疫苗的预处理和层析纯化工艺进行了研究。用碱裂解法对湿菌体进行预处理,当菌体湿重（g）∶悬浮液体积（mL）∶裂解液体积（mL）∶中和液体积（mL）为1∶2∶2∶2,碱裂解时间为8-12 min时,质粒的产量最高,可达32.94 mg/g。用Sepharose 6 FF凝胶过滤层析去除RNA和蛋白质,再用Plasmidselect亲和层析捕获超螺旋质粒DNA,质粒DNA的得率为48.3%。用L-Histidine-agarose亲和层析可从澄清的碱裂解液中一步分离纯化超螺旋质粒DNA,质粒DNA得率为51.62%。经琼脂糖核酸电泳检测,HCGβ抗肿瘤核酸疫苗超螺旋质粒DNA的纯度为100%电泳纯。     

调渗质粒pJG137(英文)

宿主范围广的调渗质粒pJG137用DNA分子克隆方法建成。基因表达表明:这一质粒是由pLA101质粒的proBA调渗基因DNA,与宿主范围广的pRK290质粒DNA克隆而成的产物。这从以下四方面加以表明:1)DNA的微型筛选;2)DNA的限制性内切酶谱;3)Southern氏DNA分子杂交,4)对抗生素和毒素的抗性。     

遗传工程基本技术研究——Ⅰ质粒DNA的提取、鉴定和转化

本文报导了质粒 DNA 的提取和鉴定方法。为了确证这种提取方法的成功,我们进行了质粒 DNA 的电镜观察以及转化试验。结果表明,所提取的质粒 DNA 分子能保持超螺旋的构形并有生物学活性。     

质粒DNA计算模型的研究

介绍了一种以非线性的闭环质粒为基础的DNA计算模型,被用于计算的质粒都有一个独特的DNA插入片断,所有的片断保持在相应的限制性内切位点,用剪切与粘贴操作完成DNA计算过程。目的是简化DNA计算过程及其模型。另外,还介绍了质粒DNA计算模型的基本思想和对应的数学描写,该模型的计算以及应用还需要以后继续研究。     

柱层析纯化质粒DNA

本文叙述了一种简便有效的纯化质粒DNA的方法,制得的质粒DNA—pBR322和pAt153分别以C600和HB101作为受体细胞进行转化,测定了对抗生素有抗性的遗传标记的转化频率。     

感受态细胞制备和质粒转化冰浴时间对大肠埃希菌转化效率的影响

通过研究转化实验中加入质粒DNA的量、大肠埃希菌感受态细胞制备和质粒转化过程中冰置时间长短对感受态细胞最终转化效率的影响,分析其最佳转化效率参数,优化感受态制备和转化方法.结果表明,加入质粒（pBR322）DNA量为1～10ng,感受态制备过程中菌液冰浴时间在30～60min,以及感受态细胞加入质粒DNA并混匀后的冰置...     

超顺磁性Fe3O4@SiO2空心亚微球的制备及其在质粒DNA分离纯化中的应用

采用溶剂热法合成超顺磁性空心亚微球,然后通过正硅酸乙酯水解-聚合反应,在亚微球表面包覆SiO₂,形成核壳结构Fe₃O₄@SiO₂空心亚微球。以该Fe₃O₄@SiO₂亚微球为分离介质,实现了大肠杆菌（E. coli）质粒DNA的高效、快速分离。     

gD2 DNA疫苗诱导细胞免疫应答

用生殖器疱疹gD2 DNA疫苗pcDNA3-gD转染哺乳动物细胞COS-7,鉴定gD表达．再用其免疫BALB／c小鼠,测定脾细胞增殖、CTL细胞杀伤活性,以及CD4^ 和CD8^ 细胞群．结果表明：pcDNA3-gD能够在哺乳动物细胞COS-7中表达gD抗原,其免疫小鼠脾细胞增殖活性增加,CTL活性达37．69％,明显高于pcDNA3组和生理盐水组;CD4^ 占T细胞数量的33．38％,数量较pcDNA3组和生理盐水组显著增加．     

氨基改性Fe3O4@SiO2核壳结构的DNA吸附特性

采用溶胶-凝胶法,以平均粒径20 nm的Fe3O4纳米颗粒为种子,在碱性环境下催化正硅酸乙酯(TEOS)水解制备Fe3O4@SiO2核壳结构纳米复合粒子;并采用前接枝方式在40℃水浴温度下,APTES为硅烷偶联剂,制备氨基功能化Fe3O4@SiO2纳米复合材料;通过透射电镜和红外光谱仪对材料的形貌和结构进行表征,并通过凝胶电泳,生物分光光度计等实验手段研究材料氨基改性前后对质粒DNA的吸附性能.研究结果表明:氨基改性后的纳米复合材料比没有改性的材料对质粒DNA具有更加良好的吸附性能,改性后的材料在吸附量和吸附速率上均有大幅度提高,且随着材料的用量加大,其最终的吸附效果也更好,并且由于材料良好的磁性能,使得被吸附的DNA能够更有效更方便地被回收.     

hPNAS-4腺病毒载体的构建及其体外抗肿瘤作用

[摘要] 目的：构建携带人的凋亡相关新基因PNAS-4(hPNAS-4)的重组腺病毒,并观察其感染人肺癌A549细胞所引起的hPNAS-4过表达对体外肿瘤细胞凋亡的影响。方法：用RT-PCR从293A细胞中克隆hPNAS-4编码区cDNA,将其酶切后连接至pENTR11载体上,再通过pENTR11与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST之间的同源重组作用将hPNAS-4基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后经293细胞的包装扩增后得到携带hPNAS-4基因的重组腺病毒;将重组腺病毒体外感染人肺癌A549细胞;用RT-PCR检测感染细胞中hPNAS-4的过表达情况;通过MTT、流式细胞术及DNA Ladder分别检测感染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从293A细胞中中克隆到hPNAS-4全长cDNA并成功构建腺病毒表达载体Ad-hPNAS-4,经测定其滴度为：2.4×108 pfu/ml,感染人肺癌A549细胞后：经RT-PCR测得其mRNA表达明显上调,MTT检测结果为细胞增殖受到明显抑制,流式细胞术测得细胞凋亡率明显升高,琼脂糖凝胶电泳显示其基因组DNA有明显的梯状条带（DNA ladder）;结论：hPNAS-4腺病毒载体感染人肺癌A549细胞后,发现hPNAS-4过表达对肿瘤细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用,为今后研究其分子机制以及hPNAS-4腺病毒载体应用于肿瘤动物实验和肿瘤基因治疗提供实验资料。     

动态反应釜制备超顺磁性Fe3O4粒子及其DNA提取

使用动态反应釜制备得到磁性粒子,与静态反应釜相比单次制备量提高20倍;通过扫描电子显微镜（SEM）、傅立叶红外光谱（FT-IR）、X射线衍射（XRD）、振动样品磁强计（VSM）等手段对产物进行表征,证明获得了粒径200 nm左右的单分散Fe₃O₄粒子,并具有超顺磁性;对其表面进行SiO₂包覆,获得具有良好分散性的Fe₃O₄@SiO₂粒子。研究发现Fe₃O₄@SiO₂对DNA提取具有可重复利用性,并且质粒DNA吸附到Fe₃O₄@SiO₂上后可直接加入聚合酶链式反应（PCR）体系作为扩增模板。     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。     

人参DNA限制片段在酵母菌中的转化

用YRp7质粒作载体,AH_(22)作受体株,将YRp7质粒和人参DNA限制片段构成的重组体转入AH_(22)中,并由大量培养的AH_(22)细胞中回收到YR_(p7)质粒和人参DNA限制片段,表明人参DNA限制片段可转入酵母菌中。     

Recovery of Excessive NH_3 in Black Liquor from NH_4OH-KOH Pulping of Wheat Straw

Aqueous ammonia mixed with caustic potash as wheat straw pulping liquor was investigated.The caustic potash not only reduced the NH3 usage and cooking time,but also provided a potassium source as a fertilizer in the black liquor.Excessive NH3 in black liquor from wheat straw NH4OH-KOH pulping process was recovered by batch distillation with a 98% recovery rate of free NH3 under atmospheric pressure and constant reflux.The temperature at the bottom of the column was controlled at 104-105℃.After removal of free NH3,the black liquor contained 8.4 g/L NH3-N and 7.04 g/L total potassium,with a substantial amount of ammoniacal lignin,and it could be used as a liquid fertilizer for farming.The height equivalent to a theoretical plate (HETP) of a rectifier for recovering free NH3 was calculated.The diameter and height of packing of the rectifier based on a daily consumption of 75 t oven-dry wheat straw were estimated.     

CpG DNA enhances the immune responses elicited by the DNA vaccine against foot-and-mouth disease virus in guinea pigs

CpG DNA is DNA sequence that has immune stimulatory effects. Several lines of investigation over the past few years indicate that CpG DNA plays an important role in the induction of immune responses to DNA vaccines. In this study, CpG DNA-containing synthetic oligodeoxynucleotide (CpG-ODN) was cloned into the eukaryotic expression plasmid encoding a fusion protein containing b- galactosidase from E. coli and immunogenic epitopes of foot- and-mouth disease virus (FMDV) type O, and the immune responses induced by the plasmid were assayed. The results showed that guinea pigs immunized with the recombinant plasmid containing CpG-ODN generated a higher level of FMDV-neutralizing antibody and a stronger T cell proliferative response and protection against viral challenge than those receiving the plasmid containing no CpG-ODN. Our study demonstrated that it is an effective route to enhance the efficacy of DNA vaccines by inserting exogenous CpG DNA into the plasmids, and the DNA vaccine developed here is a promising candidate to prevent FMDV infection.