一种导向性溶栓剂的基因构建及其在大肠杆菌中的表达

以针对人活化血小板表面糖蛋白GMP140的单克隆抗体SZ51的单链抗体作为导向分子,以单链尿激酶32kd变体(scu-PA-32k)作为效应分子,构建了一种新型的导向性溶栓剂。通过聚合酶链式反应(PCR),分别从SZ51的Fab片段基因中扩增出V_K和V_H区;从尿激酶原基因中扩增出scu-PA-32k基因。通过合适的linker及酶切位点,将V_K, V_H及scu-PA-32k基因相连接并装入表达载体pET-5a中的Nde I位点,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达了重组蛋白。Western-Blotting检测到在8mol/L尿素存在下,该重组蛋白与抗尿激酶的多克隆抗体之间仍有弱的结合反应。表达产物经变复性处理和部分分离纯化后,在纤维蛋白平板上表现有较好的纤溶活性,且这种活性是通过激活纤维蛋白溶酶原为纤溶酶而实现的。重组蛋白纤溶活性的比活达到17500IU/mg,较好地保留了尿激酶的纤溶活性,重组蛋白的产率约每100g湿菌为1.5mg。     

抗栓肽和尿激酶原（B链）嵌合体的构建与表达

通过基因工程重组技术,将抗栓肽（decorsin）基因与尿激酶的B链即scu-PA(B)基因用柔性Linker((Gly₄Ser)₃)融合在一起,构建新的嵌合体基因dscuPA(B),在大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中通过IPTG诱导表达, 并考察了重组质粒在Rosetta(DE3)plysS在传代中的分离稳定性。该融合蛋白在大肠杆菌中是以包涵体的形式存在,对包涵体进行变性及复性后,并通过Zn²⁺螯合柱和SP阳离子交换柱进行纯化。质谱分析表明分子量为33.735kD,与理论值相符。目的蛋白质的纯度可达90%。纤维蛋白平板法测得嵌合分子的比活为90000IU/mg,与scuPA-32k的比活相近。体外血小板聚集实验表明融合蛋白有较强的抑制血小板聚集的功能,抑制常数IC50为0.31μmol/L。以上这些结果表明,该融合蛋白不但具有较强的溶栓功能,而且具有抗栓功能,可能是一种具有很好发展前景的双功能溶栓抗栓药物。     

角毛壳菌β-1,4-内切木聚糖酶基因的生物信息学分析

利用BlastX将角毛壳菌(Chaetomium cupreum)ESTs序列与GenBank的Nr数据库进行相似性比对搜索,获得β-1,4-内切木聚糖酶基因全长cDNA序列。cDNA序列全长690bp,编码229个氨基酸,蛋白分子量为57.89kD,理论等电点为5.07。蛋白质的二级结构主要以无规则卷曲和延伸链为主。细胞亚定位分析表明该蛋白主要在胞外发挥水解木聚糖的生物学作用。     

人神经营养素-4基因的原核表达与纯化

以人外周血淋巴细胞基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出神经营养素-4基因(NT-4)成熟蛋白的DNA序列,并将其克隆到表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后高效特异表达了分子量约为35kD的蛋白,诱导表达的蛋白主要存在于包涵体中,经Ni^2 -NTA树脂亲和层析纯化,得到了纯度达94％的NT-4成熟蛋白的融合蛋白．为进一步研究NT-4的生物学活性及在临床治疗中的作用打下了基础．     

重组纤溶酶原激活剂及其突变体的表达研究

利用PCR技术 ,获得了人体组织型纤溶酶原激活剂tPAcDNA的缺失突变体———rPA ;在此基础上 ,运用定点突变技术 ,得到rPA的定点突变体———rPA(KHRR2 96～ 2 99AAAA) ,rPA(A473S)和二者的复合突变体rPA(KHRR2 96～2 99AAAA A473S) ;将rPA及其 3个突变体分别亚克隆至原核表达载体pET 2 8a( )中 ,获得表达载体pErA ,pErA(K) ,pErA(A)和pErA(KA) .酶切鉴定和序列分析结果均表明实现了实验设计的氨基酸突变 .表达载体转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导、菌体裂解及SDS PAGE电泳分析发现 ,只缺失而无突变的pErA和突变的pErA(A)都未表达目的蛋白 ,突变体pErA(K)与pErA(KA)则获高水平表达 ;蛋白产量分别占菌体总蛋白的 35 .97%与 37.71% ,分子量均为 39.6kD .Westernblotting显示 ,表达产物与抗tPA抗体呈特异性阳性反应 .该产物经初步纯化后进行复性与活性 (mFAPA)测定 ,结果表明其复性产物具有明显的体外纤溶活性 .以上结果为rPA突变体的进一步纯化、体内活性研究以及规模化制备提供了基础     

重组人促红细胞生成素的基本特性研究

重组EPO细胞灌注法培养的收获液,用Q SepharoseXL,C4反相疏水和Superdex75层析柱纯化表达的EPO.经SDS PAGE、PAGE和HPLC分析纯度达98%以上,总回收率为17%.经SDS PAGE分析其表观分子量为32～40kD.用IEF方法测得pI为3.75～4.15.网织红细胞计数法测得体内比活大于1.5×105IU,用ELISA测得体外活性为1.5×106～1.6×106IU.纯化的EPO的氨基酸组成和其它一些性质也进行了研究.     

分泌性表达人rPA毕赤酵母工程菌株的构建及发酵条件的初步优化

通过PCR扩增得到组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(rPA)基因片断，将该基因片断插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列载体pPIC9K中，构建了重组表达质粒pPICgK／rPA，转化Pichia pastoris GS115宿主菌．通过比较转化子在MM和MD平板上的生长状况，筛选His^ Mut^s表型转化子．并在2．0mg/mL G418平板筛选得到多拷贝转化子GR10，GR11．摇瓶培养，甲醇诱导外源基因表达，表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明重组蛋白分子量约39ku，能与特异性单克隆抗体发生免疫反应；体外气泡法测定rPA活性，结果显示重组蛋白具有较好的纤溶活性．通过正交试验，优化发酵条件，表达活性最高为1050IU／mL．     

可溶性人干细胞因子的原核表达和纯化

用Trizol提取人骨髓总RNA,通过RT-PCR扩增人干细胞因子DNA,克隆到pMD18-T载体中并测序．将其定向连入原核表达载体pET32a( ),获得了重组表达载体pET32a( )／hSCF,其cDNA长度为504bp,测序结果与已知序列吻合．然后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,获得37kD的融合蛋白,约占菌体总蛋白量的30％．经Ni^2 -NTA树脂亲和层析柱纯化获得纯度大约90％的重组蛋白．     

丝瓜ACC合成酶的原核表达、分离纯化及性质鉴定

将构建成功的丝瓜ACC合成酶cDNA的重组质粒, 转化为大肠杆菌BL21（DE3）, 经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后得到特异性高效表达, 表达蛋白以包涵体形式存在. 包涵体经洗涤和Zn^2＋螯合柱层析, 得到纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白分子量为55 000的单一蛋白带. 经活性分析, 该酶最适pH值为8.5, 米氏常数（K_m）为44.2　μmol/L.     

谷氨酰胺转胺酶在毕赤酵母菌的初步表达

从重组菌株pPIC3.5k-MTG/DH5α提取重组质粒pPIC3.5k-MTG,经Sac I酶切线性化处理后纯化重组质粒电击转化到毕赤酵母菌中,用甲醇诱导表达,经SDS-PAGE鉴定重组质粒P.pastoris GS115成功表达出了TGase蛋白,并初步纯化获得了较纯的目的蛋白,其表观分子量为47 kD,酶活为0.50 U/mL.     

噬菌体单链抗体导向溶栓剂的构建

Fibrin\|specific antibodies were isolated from a phage\|displayed single\|chain antibody(ScAb) library using affinity selection or panning.DNA shuffling was introduced to realign the specific antibody genes in order to mimic the antibody maturation in vivo. After cloning of shuffling products,a secondary library was constructed,from which the specific antibody against fibrin with higher activity was selected through panning and screening.The fibrin\|specific antibody gene and uPA functional domain gene fragment were joined together,then inserted into expression plasmid pET\|21a.The ScAb/uPA fusion protein was expressed with the induction of IPTG.In substrate S 2444 assay,the uPA activity of the chimera was about 3.1×10 3?IU/mg periplasmic protein of host E.coli .It also kept up the affinity to fibrin.     

小鼠噬菌体抗体库的构建和N-肽结合单链抗体的筛选

成功构建一库容量为1.7×10⁸的小鼠噬菌体抗体库,并从中淘选出对N-肽有结合活性的单链抗体。首先从未免疫小鼠的脾脏中提取总RNA,分离出mRNA,经逆转录合成其总cDNA。随后通过PCR分别扩增出抗体重链和轻链可变区V_H、V_L的基因片断,再经重组PCR将两片断由一编码(Gly₄Ser)₃十五肽的接头连在一起,并克隆到噬菌质粒pCANTAB 5E中,电击转化大肠杆菌TG1。经辅助噬菌体M13KO7超感染回收全部重组噬菌体,此即噬菌体抗体库。N-肽是一种新发现的神经肽,其N端与阿片肽高度同源,可与阿片肽受体相互作用。对其研究可能有助于了解成瘾机制和有临床应用价值。将生物素化的N-肽与抗体库相互作用,用偶联有链霉亲和素的磁珠富集与N-肽结合的重组噬菌体,经四轮淘选,得到亲和力较高的单链抗体。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的工业化制备与性质研究

将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵,IPTG诱导表达,其表达量为占菌体总蛋白的20％,表达产物经体外变复性、TI—Sepharose亲和层析、SP-Sepharose离子交换层析,每100L发酵液得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)纯品4g,纯度达95％以上,比活大于500000IU／mg,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准．其分子量(质谱测定)、氨基酸组成、N、C-端氨基酸序列分析等均与理论值相符．同时进行了等电点测定及肽图分析等性质研究．     

氰桥钌配合物的设计合成及谱学性质研究

设计合成了一系列二核和三核(金属离子的个数)钌(Ⅱ)吡啶和联吡啶混合配体的化合物。利用色谱柱分离法使产物得以有效的分离。这类化合物在组成上具有吡啶和联吡啶两种配体,两组元分别为顺、反结构。这种组成和结构上的特殊性,使得这些化合物的光物理和光化学性质与已有的二核化合物相比,具有独特之处：一个化合物中具有几个不同金属向配体的电子跃迁过程(MLCT)。它们的IR吸收特征,特别是氰配体成桥后IR振动频率的变化,证明了二核和三核化合物的形成。所得新化合物具有较强的光致发光性能,在一个化合物中同时具有两个不同波长的发射峰,这一发光特性与它们的二元组成是相对应的。     

人胰岛素样生长因子—Ⅰ的基因克隆,融合表达及产物纯化

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）方法,以ＩＧＦ－ＩｃＤＮＡ为模板,扩增ＩＧＦ－Ｉ的基因。在序列测定确证后,将其定向克隆到载体ｐＥｘＳｅｃＩ上,构建了ＩＧＦ－Ｉ融合表达载体ｐＥｘＩＧＦ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出约３２．５８％的２６ＫＤ融合蛋白,且主要以可溶性形式存在。经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析一步纯化后,可获得纯度约９０％的融合蛋白,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析,免疫学活性呈阳性反应。     

铟-荧光镓极谱络合吸附波的研究

在pH 5.5的0.1mol/L(CH₂)₆N₄-HCl底液中可获得铟(Ⅲ)-荧光镓体系灵敏的络合吸附波。测定铟的线性范围为1.0×10^-7～1.0×10^-5mol/L,检测限达8×10^-8mol/L, 测得电活性络合物的组成为铟∶荧光镓=1∶2,条件形成常数β=3.6×10¹³,表面电极反应速率常数k_s1、k_s2、k_s3分别为4.4、1.74、10.8s^-1,并研究了电极反应机理。     

中国人HLA-G1的cDNA克隆、序列分析、表达和蛋白质空间结构预测

从中国人外周血单个核细胞、胎盘组织和肝癌组织等样品中克隆了包含完整HLA-G1读框的cDNA;与国外同行获得的该基因及其蛋白质序列比较分析表明,该基因虽然有着细微的种族特异性,但高度保守;并获得了它的截断型重组蛋白,根据蛋白一级结构和同源比较方法,模建了它及其与特异性受体KIR2DL4形成复合体的空间结构模拟,预测了它们之间相互作用的特征.     

重组人脂联素基因构建、表达、纯化及活性鉴定

根据脂联素cDNA序列设计并合成9条寡聚核苷酸片段,经重叠PCR技术获得重组人脂联素基因.构建pET-22b( )/ADPN表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上.表达产物通过Ni-NTA柱纯化,SDS-PAGE分析显示,其分子量约为30 ku,与预期结果一致.内皮细胞生长抑制实验证实,重组人脂联素生理浓度下具有抑制人内皮细胞生长的活性并呈时间依赖性.以上工作为进一步研究脂联素的生物学功能奠定了基础.