福建省松枯死木检测鉴定方法与结果分析

采用常规检测法(贝尔曼漏斗法)研究了松枯死木中的线虫种类、相互存在关系和检出情况。初步将线虫分为4大类:松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫。其在枯死木中的存在关系有14种类型。(1)松材线虫;(2)松材线虫、拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;(3)松材线虫和伞滑刃属其它线虫;(4)松材线虫和非伞滑刃属线虫;(5)松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(6)松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(7)拟松材线虫;(8)拟松材线虫和伞滑刃属其它线虫;(9)拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;(10)拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(11)伞滑刃属其它线虫;(12)伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;(13)非伞滑刃属线虫;(14)无线虫。2008~2010年,松材线虫检出率分别为34.59%、28.21%和24.19%,呈逐年下降趋势;拟松材线虫检出率为14.04%、16.03%和0.8%。每年松材线虫检出率与季节的关系差异不明显,但常年基本上都有松材线虫,为枯死木的取样增加了难度。应用指示剂1号进行快速检测,结果表明,对于松材线虫病木,其准确率达100%。随着时间流失,松材线虫在枯死木中慢慢消失,影响常规检测和快速检测结果,所以尽量在松树枯死初期取样。     

松材线虫和拟松材线虫的繁殖力及其超氧自由基差异

采用不同毒力的松材线虫和拟松材线虫进行研究,探讨不同毒力线虫的繁殖力及虫体自身超氧自由基(O·2)释放能力差异与各虫株致病力之间的关系。对强、弱毒松材线虫和无毒拟松材线虫在单异活体培养下的繁殖力进行测定,发现三者的繁殖力从大到小依次为：无毒拟松材线虫、强毒松材线虫、弱毒松材线虫。单异活体培养下的松材线虫和拟松材线虫虫体、水培滤液的超氧自由基测定表明,两组分中的超氧自由基含量与供试线虫的毒力呈负相关,从高到低依次为：无毒拟松材线虫、弱毒松材线虫、强毒松材线虫。结果表明：供试的不同毒力松材线虫和拟松材线虫的致病力与其繁殖力无显著相关性,但与其虫体超氧自由基含量有密切关系。     

松材线虫体内细菌对宿主繁殖和致病力的影响

为探讨松材线虫体内细菌在松材线虫病中的作用,对无菌松材线虫、体内细菌处理的松材线虫和野生型松材线虫的繁殖量和致病力进行了测定。结果表明:在非寄生条件下,无菌松材线虫的产卵量、卵孵化率和繁殖量显著高于携带细菌的松材线虫; 松材线虫体内寄生菌嗜麦芽窄食单孢菌NSPmBx03胞外代谢产物对松材线虫产卵量具有一定抑制作用。不同处理的松材线虫接种到3年生马尾松后,其繁殖量从高到低为野生型松材线虫>体内细菌处理的松材线虫>无菌松材线虫。对马尾松发病情况观察发现:接种野生型松材线虫的马尾松发病最早,病程最短; 次之为接种体内细菌处理的松材线虫; 最后是接种无菌松材线虫的处理。这表明嗜麦芽窄食单胞菌NSPmBx03对松材线虫在寄生和非寄生条件下繁殖的影响不同,对松材线虫致病力有一定增强作用。     

福建省松枯死木检测鉴定方法与结果分析

采用常规检测法（贝尔曼漏斗法）研究了松枯死木中的线虫种类、相互存在关系和检出情况。初步将线虫分为4大类：松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫。其在枯死木中的存在关系有14种类型。（1）松材线虫;（2）松材线虫、拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;（3）松材线虫和伞滑刃属其它线虫;（4）松材线虫和非伞滑刃属线虫;（5）松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;（6）松材线虫、拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;（7）拟松材线虫;（8）拟松材线虫和伞滑刃属其它线虫;（9）拟松材线虫和非伞滑刃属线虫;（10）拟松材线虫、伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;（11）伞滑刃属其它线虫;（12）伞滑刃属其它线虫和非伞滑刃属线虫;（13）非伞滑刃属线虫;（14）无线虫。2008~2010年,松材线虫检出率分别为34.59%、28.21%和24.19%,呈逐年下降趋势;拟松材线虫检出率为14.04%、16.03%和0.8%。每年松材线虫检出率与季节的关系差异不明显,但常年基本上都有松材线虫,为枯死木的取样增加了难度。应用指示剂1号进行快速检测,结果表明,对于松材线虫病木,其准确率达100%。随着时间流失,松材线虫在枯死木中慢慢消失,影响常规检测和快速检测结果,所以尽量在松树枯死初期取样。     

“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”项目通过鉴定

2006年5月，我校森林资源与环境学院叶建仁教授主持完成的“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”通过了江苏省科技厅组织的科技成果鉴定。该项研究对松材线虫与拟松材线虫特异片段进行了系统筛选，共获得了7个松材线虫DNA特异片段与5个拟松材线虫DNA特异片段，为松材线虫与拟松材线虫的分子鉴定奠定了基础。首次将2个松材线虫与2个拟松材线虫的DNA特异片段成功转化为SCAR标记，丰富了松材线虫与拟松材线虫分子标记方法。首次采用SCAR标记方法成功构建了松材线虫检测试剂盒，PCR检测过程仅需2．2h。首次成功标记了一个可用于检测松材线虫的非放射性探针DlG—F2／R1。用该探针对线虫基因组DNA点杂交，松材线虫均表现有较强的杂交信号，而拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫等均无杂交信号。成功设计、合成了TaqMan探针与其配套的引物对F11／R11。     

松材线虫和拟松材线虫活体染色比较其分泌-排泄物

松树萎蔫病是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的松属树种上的一种毁灭性的病害,因此,对松材线虫致病机理的研究具有重要的理论和实践意义.根据松材线虫和拟松材线虫致病性的差异,通过活体染色对松材线虫和拟松材线虫分泌-排泄物进行了比较研究,发现松材线虫和拟松材线虫线虫分泌-排泄物存在明显的差别,这种差别可能与松材线虫的致病性有关.     

活体染色比较其分泌-排泄物

松树萎蔫病是由松材线虫(Bursa phelenchus xylophilus)引起的松属树种上的一种毁灭性的病害，因此，对松材线虫致病机理的研究具有重要的理论和实践意义．根据松材线虫和拟松材线虫致病性的差异，通过活体染色对松材线虫和拟松材线虫分泌一排泄物进行了比较研究，发现松材线虫和拟松材线虫线虫分泌一排泄物存在明显的差别，这种差别可能与松材线虫的致病性有关．     

应用PCR-RFLP技术鉴别松材线虫与拟松材线虫

应用PCR—RFLP技术分析松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为890bp，拟松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为930bp。用5种限制性内切酶对两种线虫的ITS区扩增产物进行酶切，结果表明：（1）DraⅠ酶切松材线虫群体均产生两个长度约510bp和380bp的片段，而拟松材线虫均不能被DraⅠ酶切；（2）所有的松材线虫群体与拟松材线虫群体的ITS区扩增产物均不能被ApaⅠ酶切；（3）用MspⅠ酶切松材线虫群体，除GZ02不能够被酶切外，其余样本能够产生两条长度分别为530bp和360bp的谱带。拟松材线虫群体，都能产生3条一致的亮带，长度分别为340bp、290bp、180bp；（4）所有松材线虫样本均不能被SalⅠ酶切，而拟松材线虫群体均能够被酶切为两个720bp和220bp的片段；（5）XhoⅠ酶切松材线虫ITS区为两条大小分别为520bp和370bp的谱带。而拟松材线虫产生两条大小分别为530bp和400bp的谱带。因此，内切酶DraⅠ、SalⅠ可以用于检测松材线虫与拟松材线虫。MspⅠ、ApaⅠ、XhoⅠ不宜用于鉴别松材线虫与拟松材线虫。     

松材线虫实时PCR检测技术

根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物F11/R11与探针TaqMan-11,构成松材线虫实时PCR检测方法.采用该检测方法对分离自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属线虫进行检测.结果显示,所有松材线虫株系都能够检测到荧光信号,而拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、长尾属线虫以及对照均没有检测到荧光信号.表明探针TaqMan-11与引物组合对松材线虫具有很强的特异性.此外,利用检测方法,在10μL的反应体系中,最少可以检测到0.005 Pg的松材线虫DNA含量.实时PCR也可以成功地检测出单条松材线虫.     

松墨天牛取食期间传播松材线虫的特性

【目的】系统研究松墨天牛(Monochamus alternatus)羽化后传播松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的起始和结束日期、传播松材线虫的数量及百分比、传播松材线虫数量的时间动态变化规律,以及天牛成虫携带松材线虫的数量、取食数量、寿命、传播松材线虫时长与数量之间的关系等,为松材线虫病的研究和防治提供理论参考。【方法】于松墨天牛羽化前在松材线虫病疫区收集松材线虫病病死马尾松疫木,将疫木截为1.0~1.5 m长木段并置于室外大养虫笼(2.0 m × 2.0 m × 2.0 m)中,在天牛羽化期间逐日收集新羽化的松墨天牛,并用1年生新鲜马尾松枝条(直径1~2 cm,长度25~30 cm)于室外养虫笼(0.5 m × 0.5 m × 0.5 m)中单只喂养。每3天更换1次枝条,并用测量纸测量天牛在枝条上的取食刻痕面积记为取食天牛数量,然后将枝条剪碎采用贝尔曼漏斗法分离天牛取食枝条中的松材线虫;统计每头松墨天牛每3天传播松材线虫的数量及传播松材线虫的起止日期。天牛死亡后将天牛剪碎用贝尔曼漏斗法分离天牛体内残余松材线虫,统计松墨天牛成虫寿命及携带松材线虫的数量。【结果】羽化初期传播松材线虫的天牛比例较低仅为16.7%,大多数(77.8%)松墨天牛集中在羽化后的7~12 d开始传播松材线虫。大多数(88.8%)松墨天牛在羽化后的16~30 d结束松材线虫传播。松墨天牛羽化初期传播线虫的数量较少,但1周后传播线虫数量迅速上升,并在天牛羽化后的12和24 d出现传播松材线虫的两次高峰;松墨天牛羽化1个月后维持在较低传播水平继续传播松材线虫至结束。松墨天牛携带松材线虫的平均数量为(4 303.3±7 399)条。大多数(94.4%)松墨天牛未能将携带的松材线虫全部传播到松枝上,平均传播松材线虫数量为(490.7±611.6)条,传播比例为29.8%。松墨天牛传播松材线虫的平均时长为(15.4±7.8) d。松墨天牛平均寿命为(37.8±5.6) d。【结论】雌雄松墨天牛羽化后起始传播松材线虫的日期无显著差异,但结束传播松材线虫的日期存在显著差异;松墨天牛起始传播松材线虫的日期较为集中,但结束传播松材线虫的日期较为分散,天牛传播松材线虫起止时间的特性可能与线虫在天牛体内的生理变化有关。雌雄天牛携带和传播松材线虫的数量无显著差异。雌雄天牛传播松材线虫数量的时间动态变化规律无显著差异。松墨天牛携带的线虫数量越多、传播松材线虫持续时间越长,则传播松材线虫的数量越多。松墨天牛传播松材线虫的时长不受天牛寿命以及天牛携带线虫数量的影响。松墨天牛传播线虫的数量与天牛寿命无关,但是松材线虫对天牛寿命有一定的负面影响。松墨天牛羽化后的取食量在整个成虫阶段一直保持较高水平,但无明显规律性,天牛取食数量与线虫传播量无相关性。     

人工培养条件下松材线虫提取物的毒性研究

<正>将来源于黑松、马尾松的松材线虫分别用单异活体法和无异活体法人工培养后,以不同方法和不同溶剂对培养物进行提取,并用粗提浓缩液对３０ｄ以上生的黑松和马尾松幼苗做生物测定。结果表明,在人工培养条件下松材线虫无致萎毒素产生     

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株诱导马尾松抗松材线虫病研究

【目的】蜡样芽孢杆菌NJSZ-13是1株能杀死松材线虫的松树内生细菌,研究该菌株能否诱导马尾松抗松材线虫病,为进一步开发利用该菌株抗松材线虫病提供理论依据。【方法】通过对2年生马尾松苗根部施用NJSZ-13菌株菌悬液和灭活的菌悬液后4 d再接种松材线虫,以观察不同处理的病情发展。测定该菌诱导处理后4天内和接种松材线虫AMA3虫株后28天内马尾松体内防御相关酶活性的变化。【结果】接种松材线虫后42 d,菌悬液和灭活菌悬液处理诱导马尾松抗松材线虫病的效果达54%和33%,且发病时间延迟。接种NJSZ-13菌株后,马尾松体内丙二醛(MDA)含量减少,过氧化氢酶(CAT)活性降低,而过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性均显著高于对照;接种松材线虫后,菌悬液和灭活菌悬液处理的马尾松这5种酶活性明显高于未接种菌株的马尾松苗。总体上,菌悬液处理比灭活菌悬液处理的马尾松防御相关酶活性变化显著。【结论】蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株能诱导马尾松抗松材线虫病,并且菌悬液的诱抗效果最佳。     

利用愈伤组织验证细菌分离物B619与松材线虫病的关系

用细菌分离物B619、无菌松材线虫以及它们的混合物接种黑松愈伤组织,发现无菌线虫或B619单独接种的黑松愈伤组织表现为轻微褐变;二混合接种的黑松愈伤组织严重褐变、萎缩、表现高度感病;而二得混合接种的预先用抗菌素处理的愈伤组织发病较轻。这些结果与接种黑松幼苗的结果相似,再次证明了松材线虫病是一种由松材线虫和细菌共同侵染引起的复合侵染病害。在愈伤组织中单独接种B619,接种后其数量逐渐下降,而在愈伤组织中混合接种,B619繁殖很快,其数量呈上升趋势,表明在愈伤组织内松材线虫的存在有利于B619的繁殖。     

中国江苏、浙江和甘肃与松树相关的线虫种类调查

于2008年5月至11月在中国江苏、浙江和甘肃省进行了与松树相关的线虫种类调查。对马尾松、黑松、湿地松、赤松、油松健康树及病树和死亡树的122个样木进行了检测,将分离到的线虫进行了线虫形态学光镜和扫描电镜的研究。结果共鉴定出5个属的10个种,它们分别是Bursaphelenchus xylophilus Nickle, B. mucronatus, B. aberrans , B. hofmanni, B. sp., Aphelenchoides macronucleatus Baranovskya, A. vaughani Maslen, A. bicaudatus, Ektaphelenchoides pini, Laimaphelenchus sp. Fuchs。大部分线虫发现于死亡或濒死的松树上,只有Aphelenchoides bicaudatus存在于健康黑松树种。Laimaphelenchus sp.存在于油松树皮下,这是该种线虫在中国和Seinura wuae以黑松为寄主的首次记录。     

松材线虫携带的细菌的寄生性和致病性研究

用荧光方法观察了松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）携带的细菌对悬浮培养的黑松（Pinus thunbergii）细胞的毒性,表明其中的假单胞菌、荧光假单胞菌和少动鞘氨醇单胞菌的滤液对黑松细胞具有较强的毒性,这与松树发病早期出现的细菌种类一致;这些细菌在添加松树提取液的细菌培养基上不能生长或基本不能生长,表明松树体内可能存在某些不利于细菌生长的物质;同时,单独接种这些细菌不能感染健康的黑松,因此,在线虫最初进入树体中,细菌的生长与线虫密切相关．     

喜旱莲子草与乌蔹莓等植物提取物对松材线虫的毒杀活性研究

【目的】松材线虫病是当前我国林业生产上危害最严重的森林病害。尽管投入了大量的人力、物力和财力,但松材线虫病防控形势依然严峻。化学杀线剂具有环境局限性,研发高效植物源杀灭松材线虫的药剂对控制松材线虫病疫情,同时降低环境化学污染具有重要意义。【方法】采用乙醇浸渍提取法制备喜旱莲子草(Alternanthera philoxeroides)、乌蔹莓(Cayratia japonica)、迷迭香(Rosmarinus officinalis)等30种植物的提取物,测定其对松材线虫的毒杀活性。利用液液萃取法,用乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水等有机溶剂对两种植物中的活性成分进行分步提取,得到药液的质量浓度梯度为10.000、5.000、2.500、1.250和0.625 g/L,并分别测定其对松材线虫的毒杀活性。虫卵悬浮液在25 ℃恒温保湿培养箱内培养,24 h后开始观察,32 h后结束观察。通过镜检统计线虫卵数,并计算相应的线虫卵累计孵化率和孵化抑制率。【结果】采用质量浓度为10 g/L的喜旱莲子草、乌蔹莓乙醇提取物分别处理松材线虫,72 h后线虫校正死亡率均为 100%。喜旱莲子草的乙酸乙酯萃取物和乌蔹莓的水层萃取物中存在主要的杀线活性物质,两种植物萃取物处理松材线虫72 h后的半致死剂量(LC₅₀)分别为0.588 8和0.969 3 g/L。在离体虫卵孵化试验中,喜旱莲子草的乙酸乙酯萃取物对线虫的卵孵化抑制率最大,为79.77%,其次为乌蔹莓的水层萃取物,为46.51%。【结论】可见,喜旱莲子草和乌蔹莓对松材线虫成虫和虫卵均具有较强的生物毒杀活性,可作为新型植物杀线虫剂加以开发利用。     

松材线虫在松树体内扩散及其引起的寄主细胞反应研究进展

松材线虫病是松树最危险的病害之一，在世界上一些国家都有发生并且损失惨重。寄主松树感染松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus （Steiner＆Buhrer）Nickle]40天后即可死亡。我国自1982年在南京中山陵风景区首次发现以来，到2000年底，因病枯死的松树达到2000多万株，直接经济损失25亿元，间接损失250亿元。松材线虫侵入寄主（主要是松树）后，在其体内迁移、分布及其引起的寄主内部细胞学、组织学的变化。病害发展过程与致病相关性。     

福建省松树线虫的研究I.松干伞真滑刃线虫的种类

自2001年7月至2002年12月在福建省各地共采集松树木质部样品256份，分离发现88份（34％）样品中含有伞真滑刃属Bursa phelenchus的线虫8种，本文先报道其中的4种：拟松材线虫Bursnphelenchus mucronatus Mamiya ＆ Enda,1979、赫列尼克斯伞真滑刃线虫B.hellenicus Skarmoutsos G.et al.，1998、霍夫曼尼伞真滑刃线虫B.hofmanni Braasch,H.1998、奇异伞真滑刃线虫B.aberrans Fang,et al.,2002．     

木腐真菌对松材线虫病疫木处理初探

【目的】筛选在疫木中迅速定殖扩展且能抑制松材线虫生长和繁殖的木腐真菌,在抑制松材线虫生长的同时快速降解疫木的木材成分,从而实现疫木中松材线虫在被媒介昆虫传带前就被大幅减少或不能正常进入蛹室,即在侵染循环的疫木环节即被阻断的目标,为松材线虫病的有效防控提供参考。【方法】分别将2 000条松材线虫接种至培养成熟的不同木腐真菌菌落上,通过室内平板试验测定不同木腐真菌对松材线虫生长和繁殖的影响;其次,将黑松木块接种至筛选获得具有抑制松材线虫生长和繁殖作用的木腐真菌菌落上,探究其对黑松木材的降解作用。以此筛选出能明显影响松材线虫生长繁殖且具有分解木材能力的优良木腐真菌;最后将筛选获得的优良木腐真菌经大量液体培养和固体培养繁殖后接种至田间当年染松材线虫病60 cm长的伐倒松木木段上,分别于接种后的120和150 d用电钻钻孔取木样,后将木段劈开,收集天牛蛀道周围的木样,分离并统计木样内松材线虫数量,比较接种前后疫木内松材线虫数量的变化,分析木腐真菌对疫木中松材线虫种群的影响。【结果】在室内培养茯苓菌的平板上松材线虫不能成活,在黄孢原毛平革菌、B18、C11和D16菌落上松材线虫的生长和繁殖也明显受到抑制。以接种茯苓菌后木材的质量损失率最大(7.30%),其分解纤维素和半纤维素能力也最强,分解率分别为19.21% 和29.65%;分解木质素能力最强的为黄孢原毛平革菌,分解率达到31.59%。在田间接种试验中,接种同种木腐真菌,以接种液体培养菌丝的效果优于接种固体培养菌丝的。不同木腐真菌中,以接种茯苓后减少疫木内的松材线虫数量显著优于接种其他木腐真菌处理的。接种茯苓液体培养菌丝和固体培养菌丝150 d后,均可最大程度减少疫木内松材线虫数量,减少率分别为74.51% 和65.78%。接种茯苓液体培养菌丝后天牛蛀道的松材线虫数量较接种前减少了65.45%。【结论】茯苓在室内外分解松木和减少疫木内松材线虫两方面效果均最佳;同种木腐真菌,以接种液体培养菌丝的效果优于接种固体培养菌丝的。研究表明,采用不利于松材线虫生长和繁殖的木腐真菌进行松材线虫病的疫木除治具有技术可行性和广阔的应用前景。