海南罗非鱼源维氏气单胞菌的分离、毒力基因检测及ERIC-PCR分型

从海南罗非鱼的体内分离和鉴定出40株维氏气单胞菌,并对这40株维氏气单胞菌进行了8种毒力基因检测及ERIC-PCR分型分析.毒力基因检测的结果表明:在这40株维氏气单胞菌中,主要携带6种毒力基因,即act,alt,ast,fla,lip和hlyA基因,其携带率分别为35.0%,22.5%,27.5%,37.5%,5.0%和15%,未能检测到TapA和aerA基因;根据不同菌株携带毒力基因的不同,这40株维氏气单胞菌又可分为13种毒力基因型,携带2种以上毒的菌株有15株,占总数的37.5%,携带3种以上毒力基因的菌株有9株,占总数的22.5%,其中HNWC23携带5种毒力基因,其毒力基因型为act~+alt~+ast~+hly A~+fla~+.ERIC-PCR分型结果显示:该40株维氏气单胞菌可分为四个大簇,以遗传相似度(96%)为界可将其分为18种ERIC型,每个簇中的ERIC型都呈现多样性.     

宁夏食源性单增李斯特菌毒力基因的分布研究

了解宁夏地区食源性单增李斯特菌(LM)的毒力基因分布特点.用PCR方法对85株LM进行16种毒力基因检测.结果表明,85株菌中有55株含有全部的16个毒力基因,actA基因的缺失率为22.35%,inlB和iap基因的缺失率均为10.59%,inlC基因的缺失率为9.41%,prfA和plcA基因的缺失率均为4.71%,mpl和virR基因的缺失率为分别为2.35%和1.18%.宁夏地区LM的毒力基因缺失不严重,部分食品潜在危险较大,一些毒力基因的缺失存在多样性.     

阿维链霉菌中转录因子AveR对阿维菌素生物合成的正调节

aveR是阿维链霉菌NRRL 8165阿维菌素生物合成基因簇中唯一可能的调节基因.为了验证aveR是否参与阿维菌素生物合成基因的转录调节,构建了用于敲除aveR的基因置换质粒pJTU2530,并通过接合转移引入了阿维链霉菌.通过筛选ThioSAprR转化子,经聚合酶链式反应(PCR)扩增验证,获得了aveR内部1 320 bp区域被阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV替换的突变株ZD10.高压液相色谱检测表明,与野生型菌株相比,突变株ZD10不再产生阿维菌素,并且ZD10中寡霉素的产量明显高于野生型菌株.进一步的反转录PCR(RT-PCR)分析表明,与野生型菌株相比,突变株ZD10的聚酮合酶基因aveA3不再转录.结果显示,AveR是阿维菌素生物合成的正调节因子,通过调节结构基因的转录表达来影响阿维菌素的产生.     

大肠杆菌可诱导启动子表达系统的构建

大肠杆菌作为现代基因工程最为常用的原核表达系统，其核心为基因启动元件的高效性和可控性．为了获得不依赖IPTG和温度诱导的新型启动子，克隆得到大肠杆菌中通过低pH诱导的启动子Padi，并采用点突变获得几个活性各异的启动子单元，启动子的转录效率最多提高18．8倍．结果表明：该受低pH条件诱导的启动子经点位突变后，提高转录活性的同时诱导的严谨性有一定下降；在调控蛋白和启动子的协同表达后，诱导的严谨性得到提高．     

海分枝杆菌embA低表达菌株的构建及巨噬细胞侵染实验

通过CRISPRi基因编辑技术构建阿拉伯糖基转移酶基因A(embA)低表达海分枝杆菌突变株,利用qRT-PCR技术检测相关基因转录水平。突变株侵染巨噬细胞后,台盼蓝染色测定细胞存活率,稀释涂布法检测胞内活菌数量。免疫荧光染色观察感染后巨噬细胞中F-actin细胞骨架重排和吞噬小泡的形成。分别通过Western blot和细胞因子悬液芯片方法验证小鼠巨噬细胞J774A.1胞内髓样分化因子88(Myeloid Differenti-ation factor, MyD88)表达量和细胞因子分泌。结果显示：对数生长中期野生型海分枝杆菌中glfT2和embA基因表达量增加。embA低表达突变株中embB,glfT2等6个阿拉伯半乳聚糖合成基因显著下调,但菌体形态和长度不变。与对照菌株相比,突变株侵染J774A.1巨噬细胞24 h后,细胞存活率和胞内CFU上升,吞噬小泡和骨架蛋白无明显变化。胞内MyD88蛋白表达水平增加,分泌性炎症因子TNF-α、IL-6和趋化因子RANTES、MIP-1α水平上升。本研究提示,embA表达量下降会降低海分枝杆菌的细胞毒力,但不会直接改变巨噬细胞吞噬病原菌的生理过...     

天蓝色链霉菌中S-adenosylmethionine依赖性甲基转移酶同源基因sco1162调控孢子发育及抗生素合成

利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pDZY101携带的转座子Tn101随机插入到天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)M145构建的插入突变库,从中分离到一株孢子色素及抗生素合成明显发生变化的菌株BZ100.测序发现,该突变株中Tn101插入到了链霉菌的sco1162基因中.序列分析表明,该基因编码S腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)依赖的甲基转移酶.为了验证该插入突变与表型的对应关系,构建了能在突变菌株中表达sco1162基因的互补质粒pFDZ16-1162,将该质粒转化突变株后,突变菌株的孢子形态和抗生素合成水平得到完全恢复.     

应用多重PCR法鉴定产志贺样毒素大肠杆菌毒力基因

目的：从各种来源的标本中快速鉴定STEC毒力基因，并了解其在菌株中的分布情况．方法：采用多重PCR的方法鉴定STEC的特征性毒力因子stx1，six2，eaeA和hlyA．结果：各种标本中鉴定出产志贺毒素的大肠杆菌共46株，38株(82．6％)携带stx1基因，30株(65．2％)具有six2基因，22株(47．8％)同时检测到2种基因．36株(78．3％)检测到hlyA基因，24株(52．2％)有eaeA基因．4种毒力基因即six1 stx2 eaeA hlyA的有19株(41．3％)，而且血清型均为O157．结论：产志贺样毒素大肠埃希菌毒力基因图谱是一个重要的分子流行病学标志，应用多重PCR可简便、快速、敏感、特异性地鉴定出STEC的特征性毒力基因，并依照毒力基因存在情况判定其致病性能．     

苏云金芽孢杆菌cry1基因的PCR-RFLP鉴定分析

利用PCR—RFLP技术对含有已知cry1基因的8株标准菌株和2株遗传工程菌进行了基因分析，证实了该方法的可行性．并在此基础上鉴定了分离保藏的70株B．t菌株的cry1型基因，结合SDS—PAGE分析以及室内生物测定结果，讨论了基因型与蛋白表达及毒力之间的关系．     

鸽源大肠杆菌分离鉴定、毒力基因检测及药敏试验

为了确定疑似细菌感染鸽的病原菌,以病死鸽为研究对象,进行病原菌的分离培养、生化鉴定、16S rDNA序列分析、血清型检测、动物致病性试验、毒力基因检测以及药敏试验。结果表明:此次分离的1株优势菌株,命名为QH-1,是短杆状、中等大小的革兰氏染色阴性菌,且其形态特征和生化鉴定特性与大肠杆菌相符;经16S rDNA序列分析进一步证实菌株QH-1为大肠杆菌;血清型检测结果显示,分离菌株QH-1为O26血清型分离株;动物致病性试验结果显示,分离菌株QH-1能引起鸽和小白鼠感染发病,且试验鸽发生与自然感染病例相似症状;毒力基因检测结果显示,大肠杆菌QH-1携带irp2,FyuA毒力基因;药敏试验结果显示,大肠杆菌QH-1对头孢曲松敏感;对阿莫西林、环丙沙星等耐药。疑似细菌感染的鸽病例为大肠杆菌的感染,可以选择头孢曲松进行防控。     

林可霉素转运蛋白基因lmrC的功能分析

为了研究腺苷三磷酸结合盒转运蛋白LmrC是否参与林可霉素的生物合成,通过同源重组在林可霉素高产菌株LC-G中构建了lmrC的缺失突变株XJJ7.高效液相色谱(HPLC)分析和抗性检测显示,相比出发菌株LC-G,XJJ7的林可霉素产量下降了55%,而且耐受林可霉素的最高质量浓度降低了50%.进一步实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析发现,突变株XJJ7中林可霉素生物合成基因lmbA和lmbR的转录明显低于LC-G,但调控基因lmbU的转录不变.在LC-G中lmrC的过表达不能进一步提高产量,也不影响lmbA、lmbR和lmbU基因的转录,但过表达菌株对林可霉素的抗性显著增强.结果表明,lmrC可以通过影响生物合成基因的转录来调节林可霉素的产生,并赋予产生菌一定的抗性.     

重庆市水产品中副溶血性弧菌分离株的毒力基因研究

目的:了解重庆市副溶血性弧菌分离株的毒力基因、血清型以及耐药性,为防治副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供依据.方法:采用PCR方法检测溶血素基因,并结合药敏试验以及血清分型进行综合分析.结果:323份水产品样品中共分离出的35株副溶血性弧菌,其tdh和trh基因携带率分别为14.29%、2.86%,血清群主要为:O3群、O5群、O1群;14株临床分离株主要为O1群、O3群.两组不同来源的菌株均对头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星敏感,对氨苄西林均有较强的耐药性.结论:重庆地区水产品中副溶血性弧菌的毒力基因携带率较低,但是血清型呈现多样性,且耐药性较严重,因此存在发生副溶血性弧菌食物中毒的潜在危险.     

川西北牦牛产志贺毒素大肠杆菌的流行病学调查

目的:旨在了解我国川西北草原牦牛携带的产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的血清型和重要毒力基因的分布.方法:采用玻片凝集法和PCR方法分别检测STEC的血清型和15种重要的毒力基因.结果:在277份样品中分离鉴定出STEC 85株,分离率为30.69%,存在39个不同的O血清型,无优势血清型;牦牛源STEC毒力基因stx1、stx2、cnf1、cnf2、subA、CDT-V的携带率分别为44.71%、76.47%、2.35%、2.35%、61.16%、17.65%,黏附基因eaeA、iha、saa、efa1的携带率分别为1.18%、76.47%、68.24%、2.35%,以及60-MDa毒性质粒上的基因hlyA、espP、Katp的携带率分别为75.29%、43.53%、4.71%,不携带etpD、toxB基因.结论:STEC在我国川西北牦牛中的携带率高,血清型分布广泛,黏附基因iha和saa广泛分布于各种不同血清型的STEC中,大部分STEC携带毒性质粒,公共卫生学意义值得关注.     

铜绿假单胞菌mexS基因对其运动能力的影响

使用同源重组方法构建mex S基因突变菌株PAO1mex S::Ω,检测其与铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1泳动,蹭行运动及蜂群运动能力.结果表明:与野生型菌株相比,PAO1mex S::Ω这3种运动能力均显著增加;构建mex S互补菌株PAO1mex S::ΩC,通过检测互补株的泳动、蹭行运动及蜂群运动能力,发现mex S基因回复了突变株这3种运动能力.为了探索mex S基因调控这3种运动能力的分子机制,进一步提取了PAO1与PAO1mex S::Ω菌株RNA,使用RNA测序技术比较两者全基因组转录水平,结果发现与野生型菌株相比,PAO1mex S::Ω中部分运动能力相关基因的表达水平发生了明显地变化.本文首次报道mex S基因影响铜绿假单胞菌的运动能力.     

耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的分离鉴定及生物学特性分析

以临床尿路感染患者尿液为研究对象,通过分离培养及16s rDNA进行肺炎克雷伯菌的分离鉴定;采用Kirby-Bauer纸片法进行药敏实验,并对分离株进行碳青霉烯酶表型筛选;通过PCR检测常见的碳青霉烯酶耐药基因、荚膜血清型和毒力基因分布情况;对分离的肺炎克雷伯菌株进行了生物被膜形成能力及其对小鼠致病力的分析。本研究从采取的86例尿液标本中分离检出11株耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌,分离率为12.79%。耐碳青霉烯酶基因PCR检测结果显示,blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaKPC基因在分离株中均呈现不同程度的分布。耐药性分析发现11株肺炎克雷伯菌对氨苄西林耐药率为90.91%,对头孢噻肟耐药率为63.64%,对链霉素、庆大霉素、氯霉素和诺氟沙星的耐药率较低。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌荚膜分型结果显示,分离的11株细菌中10株均为强毒力型菌株（90.9%）,其中K57血清型4株（36.4%）,K1血清型1株（9.1%）,K2血清型1株（9.1%）,K5血清型1株（9.1%）,K20血清型3株（27.3%）,提示该批分离株具有较强的致病力。此外,毒力因子分布结果显示,其毒力因子rmpA（54.5%）、Aerobactin F（54.5%）在菌株中分布较为广泛。生物被膜形成能力检测及小鼠致病性试验结果显示,9株分离株均有较强的生物被膜形成能力,菌株致病力可能与荚膜血清型及生物被膜形成能力相关。综上所述,临床分离的致尿路感染病原肺炎克雷伯菌呈现多重耐药特征,强毒力菌株以K57荚膜型为主,K1、K2均有分布,提示对尿路感染病原应加强耐药监测,合理使用抗菌药物,有效防控多重耐药和强毒力菌株的感染与流行。     

马克斯克鲁维酵母表达系统菊粉酶启动子的改造及活性研究

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)作为一种食品安全级酵母,具有生长快,生物量高等特点,是一种新型的重组蛋白表达的宿主系统.启动子是供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列,调控着转录的起始过程,直接影响基因的表达水平.本文通过易错PCR技术对马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子Pinu进行两轮突变,以阿魏酸酯酶(Est1E)作为报告基因,经筛选、鉴定获得了5个可以显著提高外源蛋白表达量的突变型启动子Pm1D81、Pm1F138、Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47,报告蛋白Est1E的酶活性是启动子改造前的2.31,2.65,5.01,5.40,5.43倍.随后测试了启动子Pm2X47对外源蛋白甘露聚糖酶和赤霉烯酮降解酶表达的影响,结果显示这两种酶的表达量均有提高,分别是启动子改造前的3.57倍和4.13倍.上述结果提示,改造后的菊粉酶启动子在提高外源蛋白表达水平方面具有一定的通用性,可作为新型候选表达元件,以提升马克斯克鲁维酵母重组表达外源蛋白的能力.     

基于sigma因子全局代谢扰动提高克雷伯肺炎杆菌的3-羟基丙酸产量

利用易错PCR技术构建了全局转录机器工程（gTME）关键元件σ因子（rpoD基因）的突变文库,连接至表达载体,电转化K.pneumoniae DSM 2026,并且从大量阳性克隆中筛选出一株3-羟基丙酸（3-HP）高产菌。初步发酵试验表明,该携带突变rpoD基因的工程菌能高效利用甘油生产3-HP,产量达到4.49g/L,比携带野生型rpoD基因的对照菌提高242.75%,甘油转化率、生产强度分别提高了832.50%、239.39%。     

mazEF系统及生物膜对北京基因型结核分枝杆菌生存能力的影响

目的探索生物膜形成能力、mazEF3,6,9系统的表达与北京基因型结核分枝杆菌生存力的相关性。方法检测北京、非北京基因型菌株与标准毒力株H37Rv在不同培养条件下的生存力、生物膜形成能力。采用PCR技术扩增上述菌株的mazE3,6,9系统,并进行基因测序;使用荧光定量PCR检测所有菌株的mazEF3,6,9基因、mazF3,6,9毒素基因和mazEF3,6,9抗毒素基因的m RNA表达水平;利用Western Blot技术检测MazF9蛋白表达水平。结果北京基因型菌株在不同培养条件下的生存力、生物膜形成能力高于非北京基因型菌株。北京、非北京基因型菌株mazF3基因193 bp处发生碱基突变,由C突变为T。在m RNA表达水平上,与H37Rv相比,北京、非北京基因型菌株中mazE3低表达;非北京菌株中mazE6低表达,mazE9高表达(P0.05)。与非北京基因型菌株相比,北京基因型菌株中mazEF3高表达、mazE9低表达、mazF3、mazF6、mazF9高表达,mazF9蛋白高表达(P0.05)。结论北京基因型菌株具有较强的生存力和生物膜形成能力。mazEF系统的差异表达、生物膜成膜能力强可能与北京基因型菌株生存能力强相关。     

苏云金杆菌晶体蛋白Cyt1A对营养期杀虫蛋白Vip3A杀虫毒力的影响

为检测苏云金杆菌晶体蛋白Cyt1A对Vip3A表达和杀虫活性的影响,将p20和cyt1A基因与vip3A基因连接构建了重组质粒pHVC20,然后电激转化至苏云金杆菌无晶体突变株CryB中进行了共表达,以单独表达Vip3A蛋白的CryB(pHPT3)作为对照菌株。Westernblot结果显示,Vip3A蛋白在CryB(pHVC20)菌株中的最大表达量约为在CryB(pHPT3)菌株的2倍,这可能是由于前者中的辅助蛋白P20增加了Vip3A表达量的缘故,晶体蛋白Cyt1A的存在对Vip3A的正常表达没有影响。生物测定结果表明,CryB(pHVC20)和CryB(pHPT3)菌株对斜纹夜蛾初孵幼虫的LC50值分别为10.62!g/ml和78!g/ml,前者的毒力比后者提高了6倍,这表明Cyt1A蛋白和Vip3A蛋白对目标昆虫的毒力可能存在着协同增效作用。     

转录因子E2F—1的DNA结合结构域与GST的融合表达和纯化

通过聚合酶链式反应方法扩增转录因子Ｅ２Ｆ－１中ＤＮＡ结合结构域的基因片段,并将其克隆到ｐＧＥＸ－２Ｔ表达载体中,转化ＢＬ２１菌株．经ＩＰＴＧ诱导,目的蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,其表达量达１５％．经ＧＳＴ－Ａｇａｒｏｓｅ亲合层析,目的蛋白得到了高度纯化．经胶迁移率改变实验（ｇｅｌｓｈｉｆｔｍｏｂｉｌｉｔｙａｓａｙ）证明目的蛋白具有与腺病毒Ｅ２启动子ＤＮＡ片段结合的能力．     

鸡乳酸脱氢酶A基因突变对DF-1细胞能量代谢和法氏囊病毒增殖的影响

通过启动子优化构建了适用于DF-1细胞的CRISPR载体；随后通过同时共转靶向GgLDHA的2条sgRNAs，获得了13株GgLDHA基因突变型细胞株，其蛋白表达水平和酶活出现不同程度的下降。通过对突变克隆细胞株生长、葡萄糖和乳酸代谢、能量代谢以及IBDV增殖研究发现，乳酸对葡萄糖得率从2.1显著下降为1.6，腺苷三磷酸（ATP）合成速率明显提高，相比对照细胞最高提高了57%，突变细胞株的能量代谢效率获得了有效改善。突变型细胞株的IBDV滴度较野生型均有明显增加，相比对照最大提高了5倍。通过定向突变GgLDHA基因，明显降低了DF-1细胞的乳酸积累，有效改善了细胞的能量代谢，并显著促进了IBDV病毒的增殖，为提高IBDV病毒疫苗的生产能力提供了一种新思路。