大批量制备人血浆纤维蛋白溶酶原

血浆经大豆胰蛋白酶抑制物、苯甲基磺酰氟和苯甲脒预处理,保持低温操作,以及赖氨酸—Sepharose 4B 亲和载体合成手续的改进,可以从近千毫升血浆中以140mg/L 血浆的产率制得低纤维蛋白溶解酶活性的纤维蛋白溶酶原制剂。     

纤维蛋白溶解酶原的纯化及性质

人血浆组分Ⅲ经Lys－Sepharose4B和SephadexG－200柱层析分离，得到分子量为90000的纯品纤维蛋白溶解酶原（HPg）．其作用的最适PH、温度、离子强度分别为6.0，25℃和0．05mol／L．Zn2＋对HPg活性有明显抑制作用；Mg2＋，Li＋，Ca2＋等离子显示了不同程度的激活作用．     

尿激酶原激活是其催化纤溶酶原激活的限速步骤

尿激酶原催化纤溶酶原的激活包括3个反应：（1）尿激酶原内在酶活性催化纤溶酶原转化为纤溶酶；（2）纤溶酶激活尿激酶原变成尿激酶；（3）尿激酶激活纤溶酶原，所以一直以来人们对尿激酶原激活纤溶酶原的过程知之甚少．研究发现EACA可以抑制尿激酶原催化的纤溶酶原激活。通过EACA对上述3个反应的影响进行逐个分析，观察到在EACA浓度为2．0mmol／L时，尿激酶原内在酶活性催化纤溶酶原激活的反应速度提高了4．5倍，尿激酶激活纤溶酶原的反应速度提高了6倍．相反地，纤溶酶激活尿激酶原变成尿激酶的反直被抑制了50％，此反应决定了EACA对尿激酶原催化纤溶酶原激活反应的抑制作用．该结果提示尿激酶原催化纤溶酶原激活反应的限速步骤是纤溶酶激活尿激酶原变成尿激酶，缘于纤溶酶和尿激酶原的赖氨酸结合位点的相互作用．     

Kunitz抑制剂家族成员抑肽酶对纤溶酶原活化的抑制作用

抑肽酶属Kunitz抑制剂家族成员，能够抑制激肽释放酶、纤溶酶及胰蛋白酶的蛋白水解活性．研究表明，抑肽酶能够抑制尿激酶型-纤溶酶原激活刹（u—PA）和组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）对纤溶酶原的激活，但不影响u—PA和t—PA对小分子底物的酰胺水解活性．用u—PA研究了上述作用的机制，发现抑肽酶与u—PA的丝氨酸蛋白酶功能区特异性结合，而与纤溶酶原没有相互作用．抑肽酶与uPA的结合并不阻断u—PA的活性位点，因为u—PA对小分子底物的水解活性仍然保持．上述发现提示抑肽酶可能存在另一种抑制作用模式，该模式不同于以前报道的关于Kunitz抑制剂或纤溶酶原激活酶抑制剂的作用．由于人体内的Kunitz抑制剂与抑肽酶在结构上非常相似，根据研究结果，推测体内纤溶酶原的激活作用并非仅受丝氨酸蛋白酶抑制剂的控制。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的药效学研究

犬静脉给予重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)1×106IU/kg、5×105IU/kg、2.5×105IU/kg对冠脉血栓产生显著的溶栓效果,栓塞冠脉血管很快出现再通,高、中、低剂量组残存血栓较溶剂对照组分别减少了72.7%、55.6%、42.5%;心肌梗死范围明显缩小.血纤维蛋白原明显降解,凝血酶原时间、凝血酶时间及陶土激活部分凝血酶时间明显延长,但抗凝血酶活性无显著改变.伤口出血量增加,出血时间延长.以上指标与等剂量(5×105IU/kg)的德国BoehringerMannheimGmbH产品Retavase作用相似.离体家兔血小板凝集实验结果表明:重组人K2tPA对家兔血小板聚集功能具有明显的抑制作用.     

产纤溶酶菌种的鉴定及纤溶酶的分离纯化

为了获得纯纤溶酶并探讨其酶学性质,从广泛收集的豆豉中筛选到一株具有高产纤溶酶能力的菌株,经鉴定为枯草芽孢杆菌.将该菌突变株DC-12N8的发酵液经离心除菌、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow和CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤,获得电泳纯的豆豉纤溶酶,每升发酵液可得到4.5mg活性酶蛋白,每克酶蛋白活力达1.18mol/s,纯度为发酵原液的53.6倍,回收率为11.7%.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,该酶是单链蛋白质,其分子质量约为28ku.     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及性质鉴定

以赤子爱胜蚓为材料，经过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤和制备电泳分离得到四种纤溶酶组分．经PAGE鉴定四种组分为单一组分；SDS-PAGE测定其分子质量分别为27、28、23和33ku；等电点均在4．0以下；经甲苯胺蓝染色后都出现糖蛋白的阳性反应；用苯酚一硫酸法测定其中性糖含量分别为8.4％、13.5％、9．1％、6．8％；纤维平板法测得四种组分的活性存在明显差异；四种组分都具有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原的双重作用．pH值对四种组分纤溶活性稳定性的影响各不相同．四种组分对温度的适应范围较广．     

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆及工程菌的构建与鉴定

利用RT-PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因,将其接入TA克隆载体PCR2．1中,经DNA序列测定后,以该重组质粒DNA为模板,用PCR方法获得了人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)基因,将其转入pET29a,构建了重组表达质粒pET29a／K2tPA,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,构成工程菌．经IPTG诱导表达,在40kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20％．该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性．     

碳源及氮源Trichoderma reesei306对组织型纤溶酶原激活剂生物合成的影响

本文对不同种类的碳．氮源对Trichoderma reesei306组组织型纤溶酶原激活剂(t—PA)生物合成的影响进行了研究。结果表明：在所试的各种碳氮源中，碳源以玉米粉和纤维素，氮源以尿素和胰蛋白胨效果最好，通过正交试验确定了液体发酵培养基中碳氮源的最佳组成为：玉米粉20g／l、纤维素30g／l、尿素10g／l、胰蛋白胨2g／l，优化碳氮源后t—PA酶活提高了26％。     

用静息细胞培养法研究影响组织型纤溶酶原激活剂生物合成的因素

建立了基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)306生物合成组织型纤溶酶原激活剂(t—PA)的静息细胞培养系统。确定静息细胞培养基的成分为：葡萄糖1．0g／L，尿素1．0g／L，K2HPO41．0g／L；静息细胞培养的条件为：选择发酵30h的菌体，10％的接种量，pH5．4，150r／min，28℃静息培养12h。并在该静息细胞培养系统中，研究了糖类、有机酸、氨基酸和金属离子等因素对里氏木霉306生物合成组织型纤溶酶原激活剂的影响。     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）在大肠杆菌中的表达、复性及分离纯化

人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ—ＰＡ）。ＤＮＡ重组在表达质粒ｐＤＲ７２０中，在Ｅ．ｃｏｌｉＣ６００中获得了表达，表达水平为２％．以醋酸钟显色ＰＡＧＥ凝胶回收ｔ—ＰＡ表达条带，进行复性处理．Ｒ性产物经Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ，Ｌｙｓｉｎｅ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析，纯化得到ＳＤＳ—ＰＡＧＥ银染一条带纯度，比活为为４，０００ｍｏｌ／ｓ·ｇ的人ｔ—ＰＡ．     

利用氨基苄脒为配基的亲和层析法纯化t—PA

利用氨基苄脒修饰的硅胶为亲和吸附剂纯化组织纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ），讨论了亲和柱体积对纯化效率的影响。由于氨基苄脒对ｔ－ＰＡ的高度特异性，根据ｔ－ＰＡ的上柱量适当调整柱体积，可使纯化倍数达到１４０以上，远高于利用其它亲和吸附剂的结果。     

疏水层析法分离纯化脂肪酶的研究

采用疏水层析法对商业解脂假丝酵母的中性脂肪酶粗制剂进行了分离、纯化,实验以Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ为固定相,异丙醇－哌嗪为流动相,经一次柱层析,从该粗酶中分离出的单一脂肪酶的比活可提高１０倍以上。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法测定其分子量约为２０．８ｋＤ;管状等电聚焦法测其等电点约为４．５０。     

桑寄生毒蛋白的分离纯化与部分性质研究

中药桑寄生(Loranthas parasiticus Merr)中的毒蛋白(简称LPT)可以用DE—52离子交换层析和Sepbacryl—S—200分子筛过滤进行分离纯化.纯化的IPT进行还原及非还原SDS—PAGE,均呈现单一蛋白带且测得分子量为43,000d,表明LPT为一单链蛋白质.LPT对骨髓瘤细胞具有杀伤作用,其半致死量ID_(?)为1.O×10~(-7)mol/L.LPT对兔网织红细胞破碎中的蛋白质生物合成也具有抑作用,其半数抑制剂量为7.0×10~(-5)mo/L.     

米曲霉(Aspergillus oryzae)植酸酶的分离纯化及性质研究

从5株霉菌中筛选出1株产胞外植酸酶最高的菌株(Aspcrgillusoryxae;简称霉菌3号)。经发酵,硫酸铵分级沉淀,Sephadex G—100凝胶过滤、SE—Sephadex G—50层析和电泳分离,获得2种植酸同工酶.此两种酶的分子量为40000d,等电点分别为4.5和4.8,最适pH为2.7和5.6,最适温度为50℃,K_m值为50μmol/L。SDS、Fe_~(2+)对酶活力无影响;Mn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)有激活作用;Cu~(2+)有抑制作用。     

人纤溶酶原Kringle 1 结构域在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化

Ｐｌａｓｍｉｎ(ｏｇｅｎ)ｗａｓｋｎｏｗｎｆｏｒｉｔｓｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｓｗｅｌｌａｓｉｔｓω ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ.Ｏｎｅｈｉｇｈａｎｄ 4ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎ .Ｃｏｎｃｕｒ ｒｅｎｔｌｙ 5ｈｉｇｈｌｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｔｒｉｐｌｅｌｏｏｐｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｎａｍｅｄａｓｋｒｉｎｇｌｅｄｏｍａｉｎｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｆｏｒｍｉｎｇ…     

猪血浆巯基蛋白酶抑制剂的分离纯化及性质研究

用(NH_4)_2SO_4分段盐析,DEAE-纤维素离子交换和Papain—Sepharose亲和层析,从猪血浆纯化了一种巯基蛋白酶抑制剂(SUlfhydryl proteinase inhibitor;简称SPI);纯化倍数为54.36倍.经高pH、低PH不连续电泳呈一条区带.含糖量为7.77％;PI为4.80.氨基酸组成分析表明,猪血SPI富含酸性氨基酸、芳香族氨基酸和含硫氨基酸.用SDS-PAGE和SephadexG-100层析,测得分子量为130000d和131000d,由两个分子量略有差别的亚基组成.对木瓜蛋白酶有强烈抑制作用,对胰蛋白酶无作用。α-螺旋结构含量高。     

柞蚕抗菌蛋白纯化及性质

从雄性柞蚕（ Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ） 蛹中分离和纯化抗菌蛋白．该抗菌蛋白由大肠杆菌诱导产生,经过 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０ 分离纯化,在 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 检测中表现为一条带,分子量在１５ ｋ Ｄａ 左右．纯化产物对大肠杆菌有明显抗菌活性,对血细胞没有凝集作用,是抗菌蛋白．     

黄色短杆菌中谷氨酸脱氢酶的分离纯化及特性

经硫酸铵盐析、DEAE-纤维素层析、苯-琼脂糖CL-4B(Phenyl-SepharoseOL-4B)层析和交联葡聚糖G-200(Sephadex G-200)层析等步骤从谷氨酸产生菌——黄色短杆菌中分离纯化的谷氨酸脱氢酶,酶活提高了230倍。该酶的分子量约为30万,由六个分子量约为5万的亚基组成,最适pH为8.9,并对热较稳定。在pH8.2时,以谷氨酸和NADP+为底物时的米氏常数值分别为0.294mol/L和0.1mmol/L。