应用~3H和~(32)P双标记法对植物细胞DNA合成率的初步研究

用放射性标记化合物掺入细胞大分子内以研究生物分子合成率,己有许多资料.鉴于细胞生物学中核酸的合成代谢有重要地位,我们采用双标记法,即~3H 标记的胸腺嘧啶核苷和~(32)P 标记的磷酸两种放射性化合物,同时掺入于细胞的DNA 组份,借以观察细胞DNA 分子的生物合成率.     

CHO M期同步细胞的研究

引言 1953年,Howard和Pelc以蚕豆根端细胞为材料,用同位素示踪方法摻入~(32)P到蚕豆根细胞DNA中,发现只有在DNA合成时才有~(32)P的掺入,而在DNA合成后到有丝分裂期之间有一间隙(gap)存在,此时~(32)P不能掺入,因此,首先提出细胞周期的概念。1959年Oastler和Sherman利用~3H-Td标记小鼠肠腺窝上皮细胞的有丝分裂象的方法测定细胞周期各时相的时间,为细胞动力学的研究提供了重要手段,他们的实验还确定了在DNA     

黑曲霉基因文库的构建及葡萄糖淀粉酶基因的克隆

用噬菌体λEMBL3 DNA为载体成功地构建了黑曲霉3758的完整的基因文库。供体黑曲霉染色体DNA经EcoRI部份酶切和蔗糖密度梯度离心,回收15—20kb片段,以一定的比例与经EcoRI处理的载体λEMBL3 DNA连接,连接产物用大肠杆菌SMR10单菌系统提取的包装蛋白进行体外包装,包装物感染宿主大肠杆菌Q359,获得2.5×10~5重组噬菌体/μgDNA的包装效率,比Clarke-Carbon公式对构建黑曲霉染色体基因文库要求的重组克隆数高10倍。以编码葡萄糖淀粉酶第329—481位氨基酸的DNA作为探针,用原位噬菌斑杂交的方法,从10~5个重组噬菌斑中筛选出2个杂交阳性噬菌斑。复筛以后,用快速法提取DNA,经EcoRI和EcoR V双酶切以后,走电泳,用Southern印迹法将DNA转移至硝酸纤维素膜上,与~(32)p-标记的探针杂交,证实葡萄淀粉酶基因位于2.5kb的EcoRI、EcoR V片段上,该片段已亚克隆至ρBR322。     

利用AFLP技术筛选与银杏性别相关的分析标记

利用amplified fragment length polymorphism(AFLP)技术,应用48个引物组合,检测了雌雄银杏基因组DNA的多态性,筛选与银可性别相关的分子标记,其中3个引物组合各提供了1个与雌性相关的分子标记。经Southern点杂交证实有两个标记为银杏雌性基因组所特有。这些分子标记的获得,为寻找性别特异的探针或PCR引物,用于银杏的性别鉴定奠定了基础。     

地高辛标记物及其应用

本文介绍了一种新型化合物—地高辛配基-11dUTP的化学合成及其应用。这种通过地高辛配基标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(Dig-dUTP),随机引物插入结合而使DNA被标记,然后用免疫酶化学检测等新技术,测定靶DNA,其灵敏度可以和同位素标记探针媲美,因此,有广阔的应用前景。     

应用聚合酶链反应与斑点印迹杂交产前诊断β地中海贫血

应用聚合酶链反应(PCR)体外基因放大,~(35)S 标记β-珠蛋白基因探针与 DNA分子杂交斑点印迹新方法,对携带者进行了基因分析,对胎儿进行了产前诊断检测。对3对夫妇的检验显示,他们分别是41-42,-28或17突变基因携带者,2例胎儿正常,1例为杂合子。     

罗汉果性别相关的RAPD标记

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术寻找与罗汉果性别相关的分子标记,筛选了130个10 bp的随机引物,发现有4个引物(S60、S90、S100、S343)能在雌、雄株DNA间扩增出5条差异性片段,大小在300~1 300 bp之间,表明这些特异带可被用来作为性别鉴别的特异性分子遗传标记。     

新型肿瘤凋亡显像PET探针的制备与表征

设计合成一种可检测肿瘤凋亡的新型正电子发射断层显像(PET)探针,并对其理化性质和生物学性质进行研究。采用"点击化学"反应将标记基团和含天门冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天门冬氨酸(Asp-Glu-Val-Asp,DEVD)序列的多肽连接得到标记前体1,通过简便的一步~(18)F标记方法制得放射性分子探针~(18)F-1,分别考察了它在PBS缓冲液和血清中的稳定性,并对其脂水分配系数进行了检测。结果显示,制备~(18)F-1所需放射性标记时间为40 min,放化纯达98%,比活度为1.5 Ci/μmol;4 h内,~(18)F-1在PBS和血清中的稳定性均大于96%;脂水分配系数为log P=-0.995±0.103,表明探针具有较好的水溶性。结果表明~(18)F-1是一个潜在的PET凋亡显像探针,值得进一步研究。     

核酸分子杂交检测黄瓜花叶病毒

为检测黄瓜花叶病毒的存在,应用Northernblot,将提取的黄瓜花叶病毒RNA样品,经甲醛变性凝胶电泳分离,使RNA解离成单链,然后用上行毛细管转移法,将凝胶上的单链RNA片段转移到尼龙膜上.经适当洗涤、干燥后,在烤箱中80℃保温2h,用于杂交.以带有黄瓜花叶病毒目的片段的细菌质粒制备DNA探针,用放射性同位素32P标记探针DNA,100℃变性处理用于杂交的探针,然后进行杂交.结果表明,在杂交膜上显示与特异性探针结合的阳性RNA条带,检测到了黄瓜花叶病毒的存在.     

基于氧化石墨烯构建新型荧光生物传感器用于DNA检测

以氧化石墨烯作为荧光猝灭基底,羧基荧光素标记的DNA探针作为识别元件,设计了一种用于检测单链DNA的新型荧光生物传感器,通过测定荧光探针分子和目标DNA作用前后体系的荧光强度变化实现特定序列单链DNA的定量检测.在该方法中,荧光强度恢复值与目标DNA浓度在20～1 000 pM范围呈线性关系,检测限为0.11 pM.该方法灵敏度高,操作简单,在生物分子检测及疾病早期诊断中具有较大的应用前景.     

“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”项目通过鉴定

2006年5月，我校森林资源与环境学院叶建仁教授主持完成的“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”通过了江苏省科技厅组织的科技成果鉴定。该项研究对松材线虫与拟松材线虫特异片段进行了系统筛选，共获得了7个松材线虫DNA特异片段与5个拟松材线虫DNA特异片段，为松材线虫与拟松材线虫的分子鉴定奠定了基础。首次将2个松材线虫与2个拟松材线虫的DNA特异片段成功转化为SCAR标记，丰富了松材线虫与拟松材线虫分子标记方法。首次采用SCAR标记方法成功构建了松材线虫检测试剂盒，PCR检测过程仅需2．2h。首次成功标记了一个可用于检测松材线虫的非放射性探针DlG—F2／R1。用该探针对线虫基因组DNA点杂交，松材线虫均表现有较强的杂交信号，而拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫等均无杂交信号。成功设计、合成了TaqMan探针与其配套的引物对F11／R11。     

分子标记技术及其应用

介绍了DNA分子标记的分类以及限制性片段长度多态性、小卫星 (minisatellite)DNA标记、微卫星(microsatellite)DNA标记技术、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性 (AFLP)和单核苷酸多态性等主要DNA分子标记的基本原理、优缺点以及它们在人类、动物等研究中的应用概况和展望。     

DNA分子标记及其在作物遗传育种中的应用

本文总结了三类DNA分子标记：(1)以Southern杂交为基础的分子标记;(2)以PCR为基础的分子标记;(3)以串连重复的DNA序列为基础的分子标记。综述了这几类分子标记在作物品种鉴定与绘制指纹图谱,基因定位与辅助选择育种,杂种优势群的划分与杂种优势的预测和细胞学研究等方面中的应用现状。     

分子标记及AFLP技术

分子标记类型可以基因表达的结果为基础,对基因的间接反映;分子标记则是DNA分子碱基序列变异的直接反映.早期利用限制性内切酶,酶切生物体DNA后来检测不同遗传位点等位变异(RFLP)和以一个碱基顺序随机排列的寡核苷酸序列为引物,利用对基因组DNA随机扩增来鉴别DNA多态性(RAPDs).真核生物基因组中普遍存在的重复序列产生了微卫星(microsatellites)标记技术.而RFLP与RAPDs有机结合形成了有着更为广阔的应用前景的AFLP技术.SNP标记利用大多数基因位点上都会有若干个等位型(alleles)为DNA芯片技术应用于遗传作图提供了基础.     

rDNA指纹图的建立及其在细菌分类鉴定中的应用

应用PCR技术,从大肠杆菌中分别扩增出16S、23S核糖体RNA基因(rDNA),以[a-32P]bATP经缺口平移法标记rDNA后作为广谱探针.选用BamhⅠ、EcoRⅠ、HndⅢ等不同限制酶,对肠杆菌科细菌及一起沙门氏菌食物中毒暴发分离株进行染色体DNA酶切,凝胶电泳分离各片段后,通过Southem杂交,获得各菌株rDNA指纹图.每个细菌都可以从rDNA的限制性片段长度多态性(RFLP)得到鉴定,rDNA指纹图显示出种特异性,明确地区分出引起食物中毒的可疑传染源.该法特异性强、重复性好,既可用于细菌的分类鉴定,也可作为分子流行病学调查的工具.     

用生物素标记核酸探针检测鼠金黄色葡萄球菌的研究

利用聚合酶链反应技术从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出 6 78bp耐热核酸酶nuc基因特异性片段 ,经生物素标记后作为核酸斑点杂交试验的探针 ,对实验动物的金黄色葡萄球菌及其临床样品进行了检测。结果显示 ,标记探针与金黄色葡萄球菌DNA呈杂交阳性 ,而与链球菌、大肠埃希氏菌和巴氏杆菌DNA呈杂交阴性 ,斑点杂交的检测灵敏度为 1pg基因组DNA。用斑点杂交试验和PCR对 2 4 0份临床样品进行了检测 ,检出率为 2 9% (7 2 4 0 ) ,符合率为 10 0 %。这些试验结果表明 ,研究制备的核酸探针及建立的斑点杂交试验具有较高的特异性和敏感性 ,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的快速检测     

与银杏性别相关的RAPD标记

应用Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)技术,筛选与银杏性别相关的分子标记,应用150个10bp随机单引物及110对随机引物组合,检测了雌雄银杏的基因组DNA,获得1个与雄性相关的RAPD标记,该标记的获得,可望进一步转化为Sequence Characterized Amplification Region(SCAR)标记或PCR标记,用于银杏早期的性别鉴定,同时该标记的获得为进一步克隆与其性别相关的基因奠定了基础。     

中药材人参鉴定技术方法的研究与评价

主要探讨现有的人参鉴定传统方法和分子生物学方法在鉴定过程中的准确性和客观性,综述了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)、随机扩增多态性DNA标记(Randomly Amplified Polymorphic DNA,RAPD)、限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)、扩增片段长度多态性分析(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)、多位点探针DNA指纹图谱和微卫星标记技术(SSR)等在人参物种鉴定中的应用,并对每种技术进行了相应的评价.     

“切伦科夫辐射”在生物学示踪中的应用

本文报告了应用国产FJ—353液体闪烁计数器,在水溶液中对~(32)P所标记的一些生物样品:消化的红血细胞溶液和低活性的水稻幼苗RNA提取液进行切伦科夫计数的结果,样品的计数率一般比G—M计数法提高约2—4倍左右。在生物样品中存在颜色时会产生淬灭而使计数率下降,这可以通过脱色或用其他淬灭校正法消除。     

应用纳米与分子探针技术对IgG抗原水平的检测

人们研究并逐步认识了纳米金与DNA等相互作用的特性和条件,并对以纳米金为基础发展起来的生物条码技术进行了更加深入的研究与应用。基于纳米金的生物条码及其相关技术研究与应用日益广泛,并不断有创新,本研究应用纳米技术并结合分子探针技术对低浓度的抗原水平进行检测。该生物条码技术常被用于检测某些蛋白、核酸、细胞或细胞因子的水平,并由此形成了不同于PCR、ELISA但仍具有高灵敏度特性的检测方法。通过磁性微球标记单抗以捕获、富集待测抗原,修饰多抗与亲和素的纳米金并结合分子信标探针起到信号扩增的作用。通过二硫键（-S—S-）分子信标探针茎部3’端的碱基T连接-生物素分子。待测抗原可将磁球与纳米金系统进行连接,然后应用二硫苏糖醇（DTT）将连接于纳米金上的MB切割下来,并与其环部完全互补配对的靶序列杂交后测定荧光强度。荧光强度与待测抗原水平（含量）相关。