用cDNA芯片技术筛选中华绒鳌蟹卵巢发育相关基因

为了克隆中华绒螯蟹卵巢发育相关基因,我们构建了中华绒螯蟹卵巢差减cDNA文库.本研究用cDNA芯片技术对中华绒螯蟹卵巢差减cDNA文库进行了初步筛选,并从cDNA芯片筛选的正向差减文库中随机选取50个克隆进行序列测定.结果共获得2倍以上差异表达克隆167个,其中Ⅲ期高表达克隆104个,Ⅱ期高表达克隆63个.正向差减文库中共获得7个独立的EST(expressed sequence tag, EST).同源性分析结果表明,这些EST皆为新的EST, dbEST登录号分别为:CA591892、CA591893、CA591894、CA591895、CA591896、CA591897和CA591898.本研究结果为进一步克隆中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的全长cDNA序列并研究其功能,阐明中华绒螯蟹卵巢发育的分子机理奠定了重要的前期工作基础.     

克隆与序列分析中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）HSP70基因全长ORF的RACE

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Edocheirsinensis)的Hsp70基因并进行序列分析.以中华绒螯蟹卵组织cDNA为模板,克隆测序后拼接得到一条长2 429 bp的cDNA序列,序列分析表明其覆盖了完整编码区,编码649个氨基酸.经antheprot分析发现2个Hsp70基因的签名序列:IFDLGGGTFDVSIL,IVLVGGSTRIPKIQK;Dnak特征基序DLGTF-S-V;非细胞器基序:RARFEEL;核定位信号标签:KKDPSESKRALRRL;胞质Hsp70特征基序GPTIEEVD.经BLASTn和BLASTx软件分析,该编码区核苷酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus uannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)的相似性分别为85.30%和84.89%.根据核苷酸序列所推导出的Hsp70氨基酸序列,其与斑节对虾、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的相似性分别为93.23%和93.40%.本研究克隆了中华绒螯蟹的Hsp70基因,为进一步深入研究锯缘青蟹的抗逆机理及其遗传改良奠定了基础.     

中华绒螯蟹卵巢新基因EJO6的全长cDNA克隆和序列分析

利用RACE技术从中华绒螫蟹卵巢获得了新基因EJO6(Eriocheir japonica ovary gene 6,EJO6)的全长cDNA序列(GenBarnk 检索号：AYl85922)。该cDNA序列长度为1250bp,开放阅读框为690bp,编码229个氨基酸。根据氨基酸序列计算的相对分子质量和等电点分别为24270和11．9。同时用生物信息学的方法对该基因的结构和功能进行了初步分析。     

中华绒螯蟹卵巢新基因EJO5的全长cDNA克隆和序列分析

利用RACE技术从中华绒螯蟹卵巢获得了新基因EJO5 (Eriocheirjaponicaovarygene 5 ,EJO5 )的全长cD NA序列 (GenBank检索号 :AY185 92 1) .该cDNA序列长度为 14 2 5bp ,开放阅读框为 5 85bp ,编码 194个氨基酸 .根据氨基酸序列计算的相对分子质量和等电点分别为 2 2 3 44和 9 5 .用生物信息学的方法未能得到对该基因功能预测的信息 .     

中华绒螯蟹Na+-K+-Cl-协同转运蛋白基因的克隆和功能分析

为研究Na~+-K~+-Cl~-协同转运蛋白(NKCC)基因在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)应对高盐胁迫过程中的作用,采用RACE技术首次克隆到中华绒螯蟹NKCC基因全长序列,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对中华绒螯蟹NKCC基因进行组织定量,并进行生物学信息分析.结果表明:该基因的cDNA全长为4 127bp,其中5非编码区(UTR)长度为18bp,3非编码区(UTR)长度为944bp,开放阅读框(ORF)长度为3 165bp,编码1 054个氨基酸.理化分析预测其分子量为51.066kDa,理论等电点为4.65.预测中华绒螯蟹NKCC二级结构由12个跨膜结构域组成.同源对比结果显示:中华绒螯蟹NKCC的氨基酸序列与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)NKCC相似度最高,为86.17%.系统进化分析表明中华绒螯蟹NKCC与拟穴青蟹、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、可口美青蟹(Callinectes sapidus)、蓝蟹(Callinectes sapidus)聚为一支.不同组织的荧光定量结果显示:NKCC基因在中华绒螯蟹的肠、脑神经节、胸神经节、鳃、胃、肝胰腺、肌肉、眼、心脏和血清中均有表达且在中华绒螯蟹肠的表达量最高.在盐度为25‰的急性胁迫下,NKCC基因在中华绒螯蟹肠中的表达量随着胁迫时间延长变化显著(P0.05),并在胁迫72h后恢复稳定.以上结果显示,NKCC基因参与了中华绒螯蟹渗透压调节,并在其渗透压平衡中发挥重要作用.     

中华绒螯蟹基因组研究概述

概述了近年来中华绒螯蟹基因组研究的进展情况，现已对13种基因的核苷酸序列进行了分析，并通过概念性翻译获得了8种蛋白质(或其亚基)的氨基酸序列，还对中华绒螯蟹的微卫星序列和序列表达标签开展了初步研究，总体上，中华绒螯蟹基因组研究较薄弱，处于起步阶段．今后应加强中华绒螯蟹基因组的广泛深入研究，重点突破一些重要功能基因的结构与功能的分析，为中华绒螯蟹的遗传改良提供理论基础。     

中国大陆绒螯蟹线粒体16SrDNA序列变异与分子鉴定标记

选取了中国大陆东部6个水系合计110个绒螯蟹个体,通过DNA序列测定和PCR/RFLP分析,对线粒体16S rDNA部分片段的序列变异进行研究.结果表明,在401bp的16S rDNA片段中,合浦绒螯蟹(Eriocheir japonica hepuensis)与中华绒螯蟹(E.j.sinensis)之间存在3～4个固定的碱基替代;合浦绒螯蟹的闽江、九龙江和南流江种群之间未发现碱基变异,表现为1种单元型(C型);中华绒螯蟹长江和辽河的种群中,有1个固定的碱基替代,表现为A,B两种单元型.单元型之间的碱基变异反映了绒螯蟹地理种群之间的遗传歧异.经Dra I酶切形成的16S rDNA酶切片段差异,为2个亚种的鉴定提供了一种准确、简捷的DNA分子标记.对长江水系部分水域绒螯蟹的分子鉴定提示,长江下游至长江口以中华绒螯蟹的2个单元型为主,但已混有合浦绒螯蟹的单元型.在江苏、安徽渔场中的饲养种群分别属于单元型A型和B型.16S rDNA的PCR/RFLP差异可作为正确鉴定中华绒螯蟹和合浦绒螯蟹的分子鉴定标记;16S rDNA片段中1个固定位点的碱基替代可作为区分中华绒螯蟹两种单元型的分子鉴定标记.     

中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体COI基因片段的序列比较研究

以相应引物PCR扩增了黄河口中华绒螯蟹线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基基因（COI）片段,PCR产物经T载体连接之后进行了克隆、测序,得到709bp的碱基序列,其A,T,G,C含量分别为34．41％,27．93％,20．03％和17．63％。并比较它与珠江流域中华绒螯蟹COI序列和日本绒螯蟹COI序列的差异,发现黄河口中华绒螯蟹与珠江 流域中华绒螯蟹COI序列完全相同,而与日本绒螯蟹差异非常明显,709或658（不计引物）位点中核苷酸差异数为32,核苷酸差异率为4．51％或4．86％（不计引物）,其中25个位点为转换,7个位点为颠换。作者倾向于支持存在中华绒螯蟹和日本绒螯蟹,或它们为同一种的两个地理亚种的观点。     

中华绒螯蟹卵巢新基因EJ05的全长cDNA克隆和序列分析

利用RACE技术从中华绒螯蟹卵巢获得了新基因EJO5（Eriocheir japonica ovary gene 5,EJO5)的全长rDNA序列(GenBank检索号：AY185921)．该cDNA序列长度为1425hp，开放阅读框为585bp，编码194个氨基酸．根据氨基酸序列计算的相对分子质量和等电点分别为22344和9．5．用生物信息学的方法未能得到对该基因功能预测的信息。     

台湾苗栗和江苏金坛池塘养殖中华绒螯蟹可食率和营养品质分析

苗栗是台湾岛的中华绒螯蟹养殖集中地区,苗栗池塘养殖中华绒螯蟹在台湾具有较好的知名度,尚不清楚其可食率和营养品质。本研究以江苏金坛区池塘养殖中华绒螯蟹为对照,测定和比较了台湾苗栗和江苏金坛两地池塘养殖中华绒螯蟹(简称苗栗蟹和金坛蟹)的成体可食率、色泽及可食组织中常规营养成分和脂肪酸组成。结果显示:(1)金坛雄蟹的出肉率显著高于苗栗雄蟹(P0.05),而2种蟹的其余组织系数和总可食率均无显著差异(P0.05)。(2)就色泽而言,苗栗雌蟹蟹壳的亮度值(L*)显著高于金坛雌蟹蟹壳(P0.05),而金坛雌蟹蟹壳红度值(a*)和卵巢黄度值(b*)显著高于苗栗雌蟹(P0.05)。(3)除性腺中脂肪和肝胰腺的碳水化合物含量存在一定水平差异外,整体两地池塘养殖中华绒螯蟹可食组织中的常规生化组成含量相近,且雌蟹卵巢中蛋白、脂肪和碳水化合物含量显著高于雄蟹精巢(P0.05)。(4)就脂肪酸组成而言,苗栗雌蟹肝胰腺中C18:1n9、C18:2n6、C20:4n6 (ARA)、C20:5n3 (EPA)、ΣPUFA和ΣLC-PUFA百分含量显著高于金坛雌蟹(P0.05);金坛雄蟹肝胰腺中EPA、DHA和Σn-3PUFA百分含量显著高于苗栗雄蟹(P0.05);就性腺中PUFA而言,不论雌雄,金坛蟹DHA、ΣLC-PUFA和Σn-3PUFA百分含量高于苗栗蟹(P0.05)。综上,台湾苗栗和江苏金坛地区池塘养殖中华绒螯蟹性腺指数、总可食率、色泽参数和常规营养组成相近,均具有重要的营养价值,两地池塘养殖中华绒螯蟹肝胰腺和性腺中的脂肪酸组成存在一定的差异,这可能与其饵料和养殖环境有关。     

中华绒螯蟹内源性白斑综合症病毒基因EjsWSSV的克隆与鉴定(英文)

基于已获得的表达序列标签序列,应用RACE技术从中华绒螯蟹基因组中获得了一个白斑综合症病毒基因(EjsWSSV)的全长cDNA序列,全长为3 864 bp并包含一个3 732 bp的开放阅读框,编码一个138.25 kDa的含1 243个氨基酸的多肽,编码的氨基酸序列包含一个VWA结构域.通过序列比对、序列结构比较和一些生物信息学预测分析,表明EjsWSSV蛋白序列与白斑综合症病毒基因组的ORF16具有高同源性,它不含有信号肽和跨膜区,为非分泌型和α-螺旋型蛋白,可能定位于细胞质.通过PCR检测验证,EjsWSSV基因可能为内源性病毒基因.     

中华绒螯蟹线粒体COⅡ基因全序列测定

通过克隆测序方法,报道了中华绒螯蟹（Eriocheir japonica sinensis)线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ(COⅡ）基因全序列,与已知甲壳动物线粒体同源序列的比较显示,绒裂蟹COⅡ基因的核苷酸组成及其编码的氨基酸组成与软甲类甲壳动物最相近似。其序列组成与密码子使用对A、T核苷酸没有明显的偏倚,对中华绒螯蟹COⅡ全序列及其序列特征的研究,为进一步研究短尾类的系统发生和绒螯蟹属的分子进化提供了分子标记。     

复方中草药对中华绒螯蟹免疫因子的影响

在基础饲料中添加6种中草药制剂煎液制成试验饲料,同时以基础饲料为对照,连续饲喂中华绒螯蟹30d,采集中华绒螯蟹血淋巴上清液测定其免疫指标活性.T检验结果表明,中草药添加饲料组蟹的噬菌活性与对照组存在显著差异(P<0.05);溶菌酶活性、酚氧化酶活性(PO)与对照组则差异极显著(P<0.01);抗菌酶活性、过氧化物酶活性(POD)差异不显著(P>0.05),但均值比对照饲料组高.说明该中草药制剂的添加能明显提高中华绒螯蟹的免疫水平.用中华绒螯蟹致病菌嗜水气单胞菌CL99920对实验蟹进行攻毒试验,嗜水气单胞菌的最佳攻毒剂量为5×106cfu/mL,对照组的死亡率为80%,明显高于中草药免疫组的死亡率30%,该中草药添加剂的免疫保护率为62 5%.     

氯化汞对中华绒螯蟹幼蟹蜕皮、生长和存活的影响

通过向水体添加不同浓度的汞(Hg2+),观察其对中华绒螯蟹幼蟹(2.01士0.16)g的毒性影响.结果表明,Hg2+对其24,48,72,96 h的半致死浓度(LC50)分别为0.542 8,0.471 6,0.433 2和0.342 3 mg/L.中华绒螯蟹幼蟹在0,0.01,0.05,0.10,0.20,0.30 mg/L的Hg2+条件下饲养40 d后,各浓度组幼蟹存活率分别为96.67%,86.67%,73.33%,63.33%,56.67%,43.33%;增重率和蜕皮率随着Hg2+浓度的升高而降低.可见水体中的Hg2+能够抑制中华绒螯蟹的生长和蜕皮,高浓度的Hg2+甚至会造成幼蟹的死亡.根据Hg2+对中华绒螯蟹的毒性作用确定水体中汞的最大允许量为0.034 2 mg/L.     

光伏板对中华绒螯蟹养殖环境和生长的影响研究

光伏发电作为清洁能源近年来不断取得发展,土地等有限资源限制光伏发电的发展,将中华绒螯蟹养殖同光伏发电结合起来是一种综合利用资源的新尝试,然而光伏板对中华绒螯蟹养殖环境及生长有无影响尚无研究.因此,本研究于2019年4月到10月,在通威南京龙袍"蟹光一体"养殖基地,检测了光伏板的存在对养殖环境和中华绒螯蟹生长情况的影响.实验设置了光伏区和非光伏区4组重复.通过检测光伏区和非光伏区养殖水体光照强度、水温、溶解氧以及伊乐藻(Elodea nuttallii)生长等指标,评估了其对水环境、伊乐藻和中华绒螯蟹生长的影响,结果显示:1)光伏板存在显著降低了水面、水下20cm以及水底的光照强度(P0.05),但其不影响中华绒螯蟹正常生长,同时光伏区水体温度显著低于非光伏区(P0.05);2)光伏板的存在影响了6、7月份伊乐藻根系生长,但能够有效避免高温季节对伊乐藻生长的不利影响;3)光伏板存在导致水体溶解氧显著低于非光伏区(P0.05),但实验组的平均溶解氧含量都高于5mg/L,能满足中华绒螯蟹正常生长所需溶解氧含量;4)光伏区雄蟹体重、体长以及体宽增长显著高于非光伏区(P0.05),同时也有利于雌蟹的生长发育.     

中华绒螯蟹育苗传统亲本选择投放关键参数的科学性

为探讨中华绒螯蟹育苗传统亲本选择投放关键参数(亲本"公3母2",选择投放雌雄性比2～3:1)的科学性,通过设置不同性比的交配实验,对中华绒螯蟹交配前后的生殖状况进行了比较研究。结果显示:在该体系下(本文代表雌雄性比为3:1组),交配后与性比1:1组一样,纳精囊内始终存乳白色精液精荚等雄性产物,抱卵个体并没有出现诸如性比5:1组中纳精囊中因缺乏精液精荚而流产现象。随着性比的提高,各组无论雄性输送还是雌性纳精囊中储存雄性产物的量均出现了较大幅度的震荡,但整体呈下降趋势。前期观察发现:这些差异可能主要与中华绒螯蟹随机交配及雌蟹未产卵之前可以多次与同一或不同雄蟹交配的生殖策略有关。因此,该参数充分兼顾了中华绒螯蟹生殖的生物学特性,保障了雌蟹交配个体均能成功抱卵,具有相当的精准性,同时这也解释了多年以来中华绒螯蟹育苗单位始终采用该参数而没有出现精子限制现象的原因。     

莠去津对中华绒螯蟹蜕皮激素分泌的影响

为了研究除草剂莠去津对中华绒螯蟹蜕皮激素分泌的影响,利用不同质量浓度(0.001,0.01,0.1,1mg/L)的莠去津对中华绒螯蟹进行染毒处理,采用酶联免疫吸附技术(ELISA)分析其对中华绒螯蟹血清蜕皮激素含量的影响.结果表明:低质量浓度(0.001,0.01mg/L)以及高质量浓度(1mg/L)莠去津暴露后,中华绒螯蟹血清中蜕皮激素含量相较对照组无显著变化,而中间质量浓度0.1mg/L的蜕皮激素含量则显著低于对照组,该质量浓度下中华绒螯蟹的蜕皮会受到一定的影响.     

中华绒螯蟹螺原体类螺旋蛋白SLP25对中华绒螯蟹和RAW264.7细胞免疫反应的研究

中华绒螯蟹螺原体是一种引起中华绒螯蟹颤抖病的新型病原微生物,对中华绒螯蟹养殖业造成了很大的损失.本文研究了螺原体的一个特有蛋白——螺旋蛋白所引起的中华绒螯蟹和小鼠RAW264.7细胞的免疫反应.克隆和原核表达中华绒螯蟹螺原体类螺旋蛋白SLP25后,用以感染中华绒螯蟹和小鼠巨噬细胞RAW264.7,用实时定量PCR和Western Blot的方法检测宿主免疫相关基因或蛋白表达量的变化.类螺旋蛋白SLP25刺激后,中华绒螯蟹的抗脂多糖因子、酚氧化酶原、消极素轻链和Peroxiredoxin 6等基因的mRNA表达量变化显著;RAW264.7细胞内的TNF-α、IL-1β和IL-10等基因的mRNA表达量变化显著,而TGF-β1和CD40的mRNA表达量变化不显著;同时RAW264.7细胞内P38和ERK蛋白的磷酸化水平变化显著,而JNK蛋白的磷酸化水平变化不显著.通过本文的研究表明类螺旋蛋白SLP25可以引起宿主广泛的免疫变化,进而证明其是重要的毒力相关因子.     

基于16S rRNA和16S-23S rRNA基因间隔区序列探讨陆生和水生螺原体菌株的系统发生关系

采集江苏省养殖池塘内发病的中华绒螯蟹、克氏原螯虾和南美白对虾,利用已有螺原体16S rRNA和23S rRNA基因序列保守引物扩增并测序16S rRNA和16S-23S rRNA基因间隔区序列(ISRs).基于已获得的序列和GenBank中下载的螺原体序列分别进行同源性比对,比对的结果分别利用PAUP软件和MrBaye...     

中华绒螯蟹不同生理时期肌肉组织中同工酶的分析比较

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对中华绒螯蟹附肢肌肉中乳酸脱氢酶(LDH)、醇脱氢酶(ADH)、酯酶(EST)、苹果酸脱氢酶(MDH)、过氧化物酶(P()D)及淀粉酶(AMY)等同工酶进行了比较分析,结果表明中华绒螯蟹附肢肌肉在不同生理阶段同工酶的表达上具有一定特异性。