应用抑制性消减杂交技术构建人肝癌组织特异表达cDNA文库

为克隆和筛选肝癌特异表达基因.应用抑制消减杂交技术对肝癌及癌旁组织进行消减杂交,产物PCR扩增后,进行克隆.共得到1820个克隆,1776个克隆有100~800bp的插入片断,阳性率达98%,说明人肝癌组织特异表达cDNA消减文库构建成功,同时我们对cDNA克隆进行测序,证明这些克隆的功能是和肝癌的发生高度相关的.抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法.     

人原发性肝癌中p16,p15基因CpG岛甲基化研究

目的　检测人原发性肝癌中 p16和 p15基因 5’启动子区CpG岛的异常甲基化 ,并分析其与人原发性肝癌发生发展的关系 ,探索其在临床早期基因诊断和治疗中的意义 .方法　用敏感的甲基化特异性PCR检测 2 0例人原发性肝癌患者癌组织、癌旁组织和远癌正常组织中p16 ,p15基因5’CpG岛的甲基化状况 ,统计分析这两个基因 5’CpG岛甲基化与肝癌病理特征的相关性 .结果　2 0例原发性肝癌肝癌组织中 p16和 p15基因 5’CpG岛分别有 6 5 %(13/2 0 )和 5 0 %(10 /2 0 )异常甲基化 ;癌旁组织中 p16和 p15基因 5’CpG岛分别有 6 0 %(12例 )和 4 0 %(8例 )异常甲基化 ;远癌正常组织中p16和 p15基因 5’CpG岛分别有 35 %(7例 )和 2 5 %(5例 )异常甲基化 .p16 ,p15基因 5’CpG岛甲基化在癌组织和癌组织旁、癌组织和远癌组织中均有相关性 .两个基因 5’CpG岛异常甲基化与临床病理特征无显著相关性 .结论　p16和 p15基因 5’CpG岛异常甲基化在人原发性肝癌中频率很高 ,可能在肝癌发生发展中扮演了重要角色 ;而...     

小菜蛾对杀虫双抗性遗传的RDA分析

采用代表性差异分析法（RDA Representational difference analysis)初步研究了小菜蛾两个品系，敏感品系和抗杀虫双近等基因系之间基因组的差异，用敏感品系作为驱动扩增子（driver)，抗杀虫双近等基因系作为检验扩增子（tester)，通过四轮消减杂交后，得到两个差异片段，范围在150bp至300bp之间，初步判断这些片段何能与小菜蛾杀虫双抗性的遗传分子基础相关。     

甲状腺癌组织端粒酶激活与p16基因失活的关系

目的探讨甲状腺癌细胞增殖、分化与端粒酶激活及抑癌基因p16失活（缺失突变）之间可能存在的关系。方法应用TRAP、多重PCR、免疫组化法检测42例甲状腺癌与16例癌旁组织端粒酶活性、P16基因外显子2缺失、P16蛋白表达。结果甲状腺癌组端粒酶活性90．48％,高于癌旁组织（P〈0．01）;甲状腺癌p16基因外显子2纯合缺失率28．57％,相应癌旁组未检出（P〈0．01）;甲状腺癌P16蛋白表达缺失率40．48％,高于癌旁组（P〈0．05）;甲状腺癌P16蛋白表达缺失率高于p16基因外显子2缺失率。结论端粒酶激活与p16基因失活以及P16蛋白表达下调可能是甲状腺癌变过程中的重要分子事件,甲状腺癌中p16基因失活可能是端粒酶激活的一种途径。     

高分辨熔解曲线法检测哈萨克族食管癌患者癌组织中FHIT、CDKN2A启动子区甲基化水平及临床意义

 建立高分辨熔解曲线法(HRM)定量检测哈萨克族食管癌患者癌组织中FHIT、CDKN2A甲基化水平,并分析甲基化水平与食管癌病理参数的相关性。选取30例食管癌癌患者癌组织及30例癌旁组织,提取DNA,进行甲基化修饰。将标准品DNA(甲基化DNA与非甲基化DNA相互的掺入)稀释成0,5%,25%,50%,75%,100%甲基化DNA,并进行重复性和灵敏性评价。应用HRM定量检测癌组织及癌旁组织甲基化水平,探讨FHIT、CDKN2A基因启动子区甲基化水平与食管癌发生发展的关系。100%,80%,50%,30%,10%,0甲基化标准品的高分辨率熔解曲线从右向左依次排列,待测基因在标准曲线上的位置即表示其甲基化程度。HRM最低检测限为1%,明显高于MSP结果最低检测限10%。在30例食管癌癌患者癌组织中,检测出存在FHIT甲基化的为36.7%。其中8例甲基化程度为0—5%,3例为5%—10%。CDKN2A甲基化的为100%,其中7例甲基化程度为0—5%,11例为5%—10%,12例为10%—25%。与正常组织比较,抑癌基因的甲基化与癌症的发生无明显相关性。进一步讨论甲基化与食管癌的病理级别以及甲基化与分化程度的关系,二者均无相关性。通过HRM技术成功建立了定量检测哈萨克族食管癌组织中FHIT、CDKN2A甲基化程度的方法,FHIT、CDKN2A基因启动子甲基化与哈萨克族食管癌的发生发展无明显相关性,但多个抑癌基因的甲基化有望成为其早期发生发展的分子指标。     

用差减cDNA文库筛选由热激导致的小鼠睾丸中差异表达的基因

采用抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization, SSH）方法,构建正常和热激小鼠睾丸组织的差减 cDNA 文库,以期 筛选出小鼠生精过程中对热敏感的基因。分别从正常和热激小鼠睾丸组织提取总RNA,反转录成cDNA,以正常小鼠睾丸组织cDNA作为待检组织(tester),以热激小鼠睾丸组织cDNA作为驱动组织(driver), 经过2轮杂交和抑制性PCR扩增,产物与T载体连接,经蓝白斑筛选,提取质粒,经EcoRI酶切鉴定插入片段并测序,由此构建了2种组织间差异表达基因的差减cDNA文库。用半定量RT-PCR方法,进一步验证 了该文库中差减出的基因基本上为差异表达的基因。对随机挑选其中的932个克隆测序,对有效测序的565个基因序列与GenBank数据库中发布的序列进行同源性比较,大部分片段都可以检索到同源序列。 结果显示,cPGES/p23等13个基因热激后表达量上调;septin2等120个基因热激后表达量下调。其中cPGES/p23为本研究中首次发现的小鼠生精过程中对热敏感的基因。     

低温胁迫下高山离子芥消减文库的构建

以0?C 低温处理12 h 的高山离子芥幼苗cDNA 为检测子,以正常生长温度下的高山离子芥幼苗cDNA为驱动子,应用抑制性消减杂交技术,构建冰缘植物高山离子芥的消减文库,筛选在低温下高表达的基因片段.随机挑取96个阳性克隆进行测序分析,得到39个独立的基因片段,26个和已知基因有较高的同源性,13个为未知基因.基因分析表明:高山离子芥在低温胁迫下,微丝交联蛋白Actin cross linking protein很可能在感受低温的过程中行使作用,而DREB2A和ABF1协同作用一起调节下游冷响应基因的表达,为进一步研究高山离子芥的抗冻机制奠定了基础.     

溴氰菊酯胁迫下小菜蛾差异表达基因的筛选与分析

通过双向cDNA RDA,即分别以敏感品系为检测子(tester)、抗溴氰菊酯品系为驱赶子(driver)和以抗溴氰菊酯品系为检测子(tester)、敏感品系为驱赶子(driver)筛选2种品系中的差异表达基因,初步分析小菜蛾敏感品系和抗性品系之间的遗传差异.经过3轮消减杂交后,将所得的差异片段克隆于PMD 18-T载体,氨苄筛选阳性克隆,经菌落PCR鉴定后送样测序.得到2条序列与GenBank数据库中的部分已知序列有一定同源性,其中1条序列与编码S3a蛋白基因有较高的同源性.     

宫颈癌组织差异表达基因的检测及分析

选取三例经分型明确为HPV16感染的宫颈癌病例,取癌组织(T)、癌旁组织(N)及远瘤正常宫颈组织(F)标本,用Roche NimbleGen芯片系统筛选出差异表达的基因并进行分析.三例标本中,癌组织与远瘤正常宫颈组织相比,差异表达基因共有673个,其中261个上调,412个下调;差异表达基因主要有原癌基因、抑癌基因、细胞信号转导、代谢、免疫应答、细胞受体、蛋白翻译合成有关基因等.     

黄鳝性别决定与SRY基因不相关

以人和鼠的SRY片断为探针与黄鳝基因组DNA进行杂交,发现雌雄黄鳝中均有相同的杂交带.用一对SRY基因保守区HMGbox的引物,在雌雄黄鳝的基因组DNA中均扩增出约200bp片段.将此片断克隆测序后发现雌雄个体中此片断仅相差1个bp,且与人的SRY基因HMG盒基因极相似.以该片段与雌雄个体的RNA进行Northern杂交未能检测到杂交带,RT-PCR反应扩增出一条微弱的200bp片段.以上结果表明:在雌雄黄鳝的基因组DNA中均存在SRY同源片断;黄鳝中的SRY同源片断可能与其性别无直接关系,而是具备其他功能,由此推测低等脊椎动物的性别决定可能由其他基因控制.     

2种三疣梭子蟹居群线粒体Cyt b和S-rRNA基因片段序列变异研究

目的：通过对2种三疣梭子蟹居群样线粒体C弘b和S-rRNA基因片段的序列分析,探讨其遗传变异,为种质资源的管理、保存和利用提供依据．方法：采集山东潍坊和福建厦门两个不同居群的三疣梭子蟹样,提取其线粒体DNA．由Genebank获得三疣梭子蟹完整线粒体DNA序列（登陆号：NC_005037）,设计扩增Cyt b和S-rRNA基因片段引物,经PCR扩增获得预期产物,纯化后测序．结果：以提取的线粒体DNA为模板扩增出特异性强的Cyt b和S-rRNA基因片段,与预期条带长度429bp和465bp吻合;2个基因片段的AT含量均高于GC含量;Cyt b基因片段有3个位点发生了突变,S-rRNA只有1个位点发生了突变;在两种居群的4个突变位点中,2个位置突变为相同的碱基,且所有突变位点均呈转换方式．结论：Cyt b基因序列比S-rRNA基因序列具有相对高的突变率;研究的2个基因片段的突变位点的碱基置换主要呈转换方式;来自2个三疣梭子蟹居群样本的线粒体S-rRNA基因的突变发生在同一位点且突变为相同碱基,表明2个居群具有较近的亲缘关系．     

银染mRNA差异显示法的建立及其应用

以银染mRNA差异显示方法对原发及转移灶胃癌标本总RNA为研究对象进行银染差示分析和回收差异条带,从中获得系列差异表达片段。随机选取5个从原发性胃癌样品回收的表达条带,以取自体外培养胃癌细胞株的RNA进行点杂交验证,均被证实为真实带。对2个差异表达片段进行分析、测序和GenBank同源比较结果表明：MGD1片段与肿瘤转移相关基因MTA1完全同源,属胃癌转移相关基因;PGD2与胃癌转移抑制相关,并与细胞周期抑制蛋白p27／Kip1具99％的同源性。结果表明,银染差异显示法具有快速、直观、假阳性率低等优点,同时也为进一步研究胃癌转移的相关基因提供了新线索。     

Amplification of immunoglobulin lambda constant genes in populations of wild mice

The lambda immunoglobulin light chain (Ig lambda) locus of BALB/c inbred mice consists of two variable region gene segments (V lambda)1-3, and four constant region gene segments (C lambda)1,2,4,5. Each C lambda gene segment is associated with a unique joining segment (J lambda)2,4-7, and they are organized in two paired units, J3C3-J1C1 and J2C2-J4C4 (refs 4, 8). Using cDNA probes specific for C lambda 1 and C lambda 2 (ref. 9) we have analysed the genomic organization of the C lambda gene segments in wild-derived and inbred strains of mice. Although Southern blots of the genomic DNA of inbred mice show a constant pattern of hybridization, wild-derived mice show a high degree of variation in the number, size and intensity of hybridizing fragments. We have now found that, per haploid genome, mice of a Mus musculus musculus stock isolated from Sladeckovce, Czechoslovakia (CzII) have at least 12 C lambda segments, and mice of a Mus musculus domesticus stock 'Centreville Lights' from Centreville, Maryland (CL) have at least 8 C lambda segments. There appears to have been relatively recent amplifications of the C lambda gene segments in wild mice.     

线粒体基因种属鉴定复合扩增体系

针对cyt b基因和ND6基因序列,设计两对引物,以14种常见动物（包括人）生物性检材为对象进行PCR扩增,产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、硝酸银染色进行分析。结果证明,两条电泳条带者为人样本,分别是cyt b基因片段（358 bp）和ND6基因片段（181 bp）;一条电泳条带者为动物来源,是358 bp cyt b基因片段。在37.5μL PCR反应体系中最小检出模板量为0.25 pg基因组DNA。检材在4℃、室温和37℃温度下,经过4个月后均可获得正确的种属区分。高度潮湿环境中放置50 d的检材、形成于水泥地面、墙面、泥土等基质上的血痕,本方法可得到正确区分。由此建立的种属鉴定的线粒体基因复合扩增体系,其检测片段短、灵敏度高、操作简易,适合法医学上微量、降解、陈旧检材的种属判定。     

血管内皮生长因子936^＊T／C基因多态性与胃癌的关系

研究血管内皮生长因子（VEGF）936^＊T／C基因多态性与胃癌之间的关系,了解该基因多态性对胃癌生成及发展的影响。采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测胃癌患者和健康者外周血的VEGF936。T／C基因型。结果,胃癌患者外周血中VEGF936。T／C基因型或等位基因与健康者相比无差异（精确概率法计算基因型P=0．226;卡方检验等位基因x^2=2．934,P=0．087）。Ⅲ、Ⅳ期病理分期患者C／C基因型和c等位基因比例（66．7％和82．0％）明显大于Ⅰ、Ⅱ期（12．9％和1．2％）,两者差异有统计学意义（基因型：x^2：14．215,P=0．000;等位基因：X2=28．430,P=0．000）。结果表明,VEGF9360C／C基因多态性与胃癌的生成无关,而与胃癌的进展相关。     

乙酰肝素酶与甲状腺乳头状癌淋巴结转移的相关性研究

【目的】通过研究乙酰肝素酶(HPA)含量与微淋巴管密度的关系,探讨HPA在甲状腺乳头状癌淋巴结转移中的作用。【方法】采用Envision免疫组织化学两步法检测150例甲状腺乳头状癌和200例结节性甲状腺肿患者乙酰肝素酶、D2-40的表达情况,计算乙酰肝素酶平均光密度值与D2-40阳性标记的微淋巴管密度,分析乙酰肝素酶含量与微淋巴管密度间的关系,同时与结节性甲状腺肿患者微淋巴管密度和乙酰肝素酶含量分别进行比较。【结果】甲状腺乳头状癌患者微淋巴管密度和乙酰肝素酶含量明显高于结节性甲状腺肿患者(P0.01),癌组织乙酰肝素酶含量与微淋巴管密度呈正相关关系(P0.01)。【结论】甲状腺乳头状癌患者乙酰肝素酶与微淋巴管形成有密切关系,乙酰肝素酶可作为其临床疗效判断和新药研发的参考指标。     

乐至黑山羊GH和IGF-I基因多态性及其与产羔性状的关联性分析(英文)

生长激素(GH)胰岛素样生长因子I(IGF-I)在卵泡的生长和闭锁中发挥关键作用。研究采用PCR-SSCP技术对157只乐至黑山羊GH和IGF-I进行多态位点的检测。结果发现,GH基因5’侧翼区和第二外显子分别检测到2种基因型,第三外显子检测到4种基因型,第四和第五外显子分别检测到3种基因型;IGF-I基因的第二外显子检测到2种基因型。通过基因测序发现GH基因有14处单核苷酸突变位点(SNPs)—T48C,A55G)(P1引物),T781C(P2引物),G1122A,A1161G,A1171G,C1179T和C1180G(P3引物),T1481C,A1494G,G1549T和C1590T(P4引物),G1942A和G1957A(P5引物);IGF-I基因有1个SNP(G3270C)(P6引物)。关联性分析结果表明,只有GH基因第三外显子BB型乐至黑山羊产羔数比AA型多0.32(p0.05),其余基因型间产羔数差异不显著。研究初步表明GH基因可能与乐至黑山羊产羔数之间存在一定关联性。     

Survivin基因在胃癌组织中的表达及其与凋亡的相关性研究

目的研究胃癌组织中Survivin基因的表达及其与凋亡的关系。方法应用免疫组织化学SP法检测30例正常胃粘膜及120例胃癌组织中Survivin基因的表达;采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）技术,检测其凋亡指数。结果30例正常胃粘膜组织Survivin基因均不表达,胃癌组织中Survivin阳性率为62．5％（75／120）,二者有显著性差异（P〈0．01）;Survivin基因表达与组织分化程度和TNM分期密切相关（P〈0．05）。胃癌组织凋亡指数（AI）和TNM分期、组织分化程度密切相关（P〈0．05）。Survivin基因表达水平与凋亡指数呈显著负相关（P〈0．01）。结论Survivin基因在胃癌的发生发展过程中可能起重要作用。Survivin基因的表达可抑制胃癌细胞凋亡、促进胃癌细胞增殖。